骨碎補(bǔ)外用對(duì)實(shí)驗(yàn)性豚鼠白癜風(fēng)的影響*

沈 麗，張德芹，黃云英，王雪妮，杜 娟，王元元

骨碎補(bǔ)為水龍骨科植物槲蕨 [Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.]的干燥根莖，其味苦，性溫。歸肝、腎經(jīng)，是一味既可內(nèi)服又可外用的常用中藥。歷版《中國(guó)藥典》對(duì)骨碎補(bǔ)內(nèi)服功能及主治均有詳細(xì)的記載，但在骨碎補(bǔ)外用功能及主治方面，缺少能指導(dǎo)其臨床“外治斑禿，白癜風(fēng)”的外用功能。2010年版《中國(guó)藥典》將骨碎補(bǔ)的功能主治規(guī)范為“療傷止痛，補(bǔ)腎強(qiáng)骨；外用消風(fēng)祛斑。用于跌撲閃挫，筋骨折傷，腎虛腰痛，筋骨痿軟，耳鳴耳聾，牙齒松動(dòng)；外治斑禿，白癜風(fēng)”，填補(bǔ)了骨碎補(bǔ)長(zhǎng)期以來(lái)外用功能的闕如[1]。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)方法用黃酒調(diào)和骨碎補(bǔ)粉末，外用治療實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)模型，觀察骨碎補(bǔ)對(duì)機(jī)體黑色素合成的影響，進(jìn)一步證實(shí)了骨碎補(bǔ)外用具有治療白癜風(fēng)的功效，為2010年版《中國(guó)藥典》完善骨碎補(bǔ)外用功能，增補(bǔ)“外用消風(fēng)祛斑”提供藥效學(xué)參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Infinite M200微量多功能讀板機(jī)Tecan；Olympus照相顯微鏡；酪氨酸酶（Sigma chemical Co.批號(hào) 120M7001）；L-多巴（Sigma chemical Co.批號(hào)080M1712V）；膽堿酯酶(CHE)測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20110624）；單胺氧化酶（MAO）測(cè)定試劑盒（Cusabio公司，批號(hào)C04200783）；過(guò)氧化氫（天津市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠，批號(hào)20110217）；其余試劑均為分析純。

1.2 藥物 骨碎補(bǔ)藥材（購(gòu)于安徽亳州藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地：江西，批號(hào)：201103-2。由天津中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室李天祥老師鑒定為水龍骨科植物槲蕨[Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.]的干燥根莖；甲氧沙林（重慶華邦制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：2010005）。

1.3 動(dòng)物 健康黑花色豚鼠，體質(zhì)量（300±20）g，雄性，由北京沙河通利實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供,動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2010-0004。

2 方法

2.1 藥液的制備 將骨碎補(bǔ)藥材打成粉末，過(guò)100目篩。取骨碎補(bǔ)粉末15 g，用黃酒配成生藥0.25 g/g的藥液。

2.2 模型的制備 黑花色豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成6組，每組8只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、甲氧沙林對(duì)照組、骨碎補(bǔ)高、中、低劑量組。用電動(dòng)剃毛刀剃去背部長(zhǎng)毛，用刀片剃去背部短毛，面積約4 cm×4 cm。除正常組涂等量純化水外，其余各組在脫毛區(qū)涂5%過(guò)氧化氫1 mL，每日2次，連續(xù)40 d，建立實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)動(dòng)物模型。在此期間每日脫毛 1 次[2-3]。

2.3 給藥方案 從造模第11天開(kāi)始各組分別在涂過(guò)氧化氫后1 h給藥。正常對(duì)照組：不做任何處理；模型對(duì)照組：涂抹等體積黃酒；甲氧沙林對(duì)照組：涂抹甲氧沙林1 mL；骨碎補(bǔ)高、中、低劑量組涂抹骨碎補(bǔ)藥液，每日用藥劑量分別為1.40、0.70、0.35 g/kg。每日涂藥1次，給藥1h后，照日光15min,連續(xù)30d。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 表皮觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，肉眼觀察豚鼠背部皮膚色素分布。療效判定標(biāo)準(zhǔn)[4]（以豚鼠用藥部位中心3 cm2為一觀察單位）：優(yōu)為受試區(qū)（3 cm2)色素基本恢復(fù)正常；良為受試區(qū)出現(xiàn)色素面積>50%；中為受試區(qū)色素面積<50%；差為受試區(qū)皮膚仍呈蒼白或白斑狀；總有效率以優(yōu)加良計(jì)。

2.4.2 指標(biāo)測(cè)定 末次給藥后2 h，豚鼠用3.5%的水合氯醛麻醉后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心20 min分離血清和血漿，進(jìn)行血漿酪氨酸酶（TYR）和血清CHE、MAO的測(cè)定。

2.4.3 病理觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后于用藥部位的中心取1 cm×1 cm皮膚，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木-伊紅（HE）染色，觀察標(biāo)本組織學(xué)的變化。用硫酸亞鐵Lillie法進(jìn)行黑色素染色，觀察50個(gè)毛囊，計(jì)算其中有黑色素毛囊數(shù)及皮膚黑色素分布情況。判定標(biāo)準(zhǔn)[5]：“-”表示表皮基底細(xì)胞及棘層無(wú)黑色素;“±”表示表皮基底細(xì)胞及棘層偶見(jiàn)黑色素;“+”表示表皮基底細(xì)胞及棘層1/3~1/2有黑色素;“++”表示表皮基底細(xì)胞及棘層1/2以上有黑色素;“+++”表示表皮基底細(xì)胞及棘層均有黑色素。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 18.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，組間比較用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 表皮觀察 模型組皮膚顏色明顯變淺，膚色蒼白，甚至原有黑毛處長(zhǎng)出白毛。治療組肉眼觀察膚色變淺程度弱于模型組。甲氧沙林組的干燥、脫屑現(xiàn)象較骨碎補(bǔ)組明顯，酒浸的骨碎補(bǔ)在一定程度上防止了皮膚干燥并減輕了皮膚脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)皮膚造成的損害。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 骨碎補(bǔ)對(duì)白癜風(fēng)模型豚鼠影響的療效觀察（3 cm2/觀察單位，n=8）例

3.2 生化測(cè)定 結(jié)果見(jiàn)表2。

3.2.1 TYR活性 和正常組相比，模型組下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），和模型組相比，甲氧沙林組TYR活性明顯升高（P<0.01），骨碎補(bǔ)給藥組隨濃度的增加有逐漸升高的趨勢(shì)。

3.2.2 CHE活性 和正常組相比，模型組下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），和模型組相比，甲氧沙林組和骨碎補(bǔ)高劑量組活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3.2.3 MAO活性 和正常組相比，模型組升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，和模型組相比，甲氧沙林組和骨碎補(bǔ)高劑量組活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），骨碎補(bǔ)中劑量組活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 骨碎補(bǔ)對(duì)白癜風(fēng)豚鼠模型TYR、CHE、MAO的影響（s，n=8）U/mL

表2 骨碎補(bǔ)對(duì)白癜風(fēng)豚鼠模型TYR、CHE、MAO的影響（s，n=8）U/mL

注：與模型組相比*P<0.05，**P<0.01。

組別 劑量（g/kg）TYR CHE MAO正常對(duì)照組 - 6.64±0.63* 83.37± 5.76**13.77±1.42模型對(duì)照組 - 6.07±0.24 52.53± 6.93 14.29±0.58甲氧沙林對(duì)照組 1mL/只 7.11±0.59**75.81± 7.98**12.65±1.28**骨碎補(bǔ)高劑量組 1.4 6.39±0.58 64.40± 6.19**12.32±0.96**骨碎補(bǔ)中劑量組 0.7 6.33±0.70 57.88±12.76 13.01±0.70*骨碎補(bǔ)低劑量組 0.35 5.91±0.19 57.38± 9.77 13.88±1.02

3.3 病理觀察 光鏡檢查發(fā)現(xiàn)模型組和用藥組棘層明顯增厚，角質(zhì)增厚明顯，模型組基底層和棘層黑色素明顯缺失，用藥各組的黑色素分布基本恢復(fù)至正常水平，棘層增厚程度較模型組減弱，說(shuō)明骨碎補(bǔ)對(duì)白癜風(fēng)模型具有治療作用。結(jié)果見(jiàn)表3，正常組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），骨碎補(bǔ)高劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表3 骨碎補(bǔ)對(duì)白癜風(fēng)模型豚鼠皮膚黑色素的影響（s，n=8）

表3 骨碎補(bǔ)對(duì)白癜風(fēng)模型豚鼠皮膚黑色素的影響（s，n=8）

注：與模型組相比*P<0.05，**P<0.01。

量/kg）-±++++++- 0 0 1 3 4 46.63±2.92**模型對(duì)照組 - 0 4 3 1 0 41.25±3.20甲氧沙林對(duì)照組 1 mL/只 0 0 2 4 2 43.38±2.67骨碎補(bǔ)高劑量組 1.40 0 1 2 2 3 45.38±2.83*骨碎補(bǔ)中劑量組 0.70 0 0 1 3 4 44.38±2.45骨碎補(bǔ)低劑量組 0.35 0 0 4 1 3 40.50±4.50皮膚色素分布 有黑色素毛囊數(shù)（個(gè)）

4 討論

白癲風(fēng)是由多種原因引起的色素代謝障礙性疾病，臨床上以皮膚色素脫失斑為特征。由于酪氨酸酶（TYR）是各種生物體內(nèi)色素形成的關(guān)鍵酶，所以能夠激活酪氨酸酶、增強(qiáng)其活性的藥物，可促進(jìn)色素的合成，有助于白癲風(fēng)病損區(qū)色素的恢復(fù)。

臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者的皮損區(qū)CHE活性降低，膽堿能活性增加，交感神經(jīng)興奮性增高，以及MAO值升高。近年來(lái)許多學(xué)者在探討MAO、CHE等和黑色素合成的關(guān)系[6]，提出交感神經(jīng)興奮性增加，一方面可能會(huì)導(dǎo)致MAO活性增加；另一方面可能導(dǎo)致褪黑激素等介質(zhì)的釋放增加，使黑色素合成減少，進(jìn)而出現(xiàn)過(guò)氧化氫聚集導(dǎo)致黑色素合成減少。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用5%的過(guò)氧化氫造模后，白癜風(fēng)模型組豚鼠血液中TYR含量降低，CHE活力降低，MAO活力增加，與正常組豚鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與臨床白癜風(fēng)患者病理狀況類似，采用5%的過(guò)氧化氫可復(fù)制實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)模型動(dòng)物。用骨碎補(bǔ)后TYR含量升高，MAO活力降低，CHE活性增加，提示骨碎補(bǔ)對(duì)白癜風(fēng)有治療作用，從而為2010版《中國(guó)藥典》增補(bǔ)外用“消風(fēng)祛斑”功能提供藥效學(xué)依據(jù)[7]。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：290.

[2]龍子江，白 玫，樊 彥，等.化學(xué)脫色法制備白癜風(fēng)動(dòng)物模型[J].安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，16（6）：60-62.

[3]Imokama G,Kawai M,Mishima Y,et al.Differential analysis of experimental hypermelanosis induced by UVB,PUVA,and allergic contact dermatitis using a brownish guinea pig model[J].Arch Dermatol Res,1986,278(5):352.

[4]全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)會(huì)色素病理學(xué)組.白癜風(fēng)臨床分型及療效標(biāo)準(zhǔn)（草案）[J].中華皮膚科雜志，1995，28（3）：212.

[5]盛國(guó)榮.祛白酊對(duì)實(shí)驗(yàn)性白癜風(fēng)的治療作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（2）：57－59.

[6]張汝芝，朱文元.過(guò)氧化氫與白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·皮膚性病學(xué)分冊(cè)，2002，28（6）：356－359.

[7]郝存江，趙曉峰.納米中藥研究進(jìn)展[J].天津中醫(yī)藥，2006，23（6）：515.