和田苜蓿組織培養中玻璃化現象研究

王庭輝，馬暉玲

（甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）屬豆科多年生植物，是世界上最重要的飼料作物，有“牧草之王”的美稱，目前世界苜蓿栽培面積為3500萬hm2，在我國已有2000年的栽培歷史［1］。自1958年Renert和Steward從胡蘿卜愈傷織和懸浮細胞體系中獲得體細胞胚以來，植物組織培養技術得到了迅速發展。隨著組織培養技術的不斷完善，使得生物技術在育種上的應用成為了可能，大大加快了我國牧草育種的進展［2］。王發生等［3］對紫花苜蓿愈傷組織誘導及植株再生做了詳細研究。但是，在植物組織培養過程中超度含水態苗［4，5］，由于其難以移栽成活，嚴重影響植物組織培養技術的發展和應用。1981年Debergh等［6］提出了試管植物“玻璃化作用”的概念。陳兵先等［7］對植物組織培養中玻璃化現象做了詳細報道。

通過組培體系獲得轉基因植株，是目前生物技術手段改良植物品種的途徑之一，而組培過程中出現的污染，褐化和玻璃化是影響植物組培體系建立的3大難題［8］，隨著轉基因技術的發展，組培體系顯得尤為重要。陶銘［9］通過研究發現導致再生苗玻璃化的原因主要有培養基、培養容器、環境條件及外植體種類等，但其誘發機理至今尚無定論。李云霞等［10］以新疆大葉，甘農三號和隴東苜蓿為試材，對紫花苜蓿組培體系中常見褐化原因進行了分析并提出了解決辦法。吳麗芳等［11］對紫花苜蓿組織培養中常見問題也提出了解決對策。同時，亓建飛等［12］對組培中畸形苗的發生機理做了闡述。擬通過摸清影響和田苜蓿組織培養過程中玻璃化現象產生的部分因素，提出應對措施，為消除紫花苜蓿組織培養過程中的玻璃化現象提供一定的參考依據。

1 材料和方法

1.1 材料

成熟的和田苜蓿種子采自新疆和田地區民豐縣苜蓿原種站。

1.2 方法

挑選飽滿顏色較好的新疆和田苜蓿種子，用自來水浸泡40min，用75%酒精處理30s，后用0.1%升汞浸泡10min，無菌水沖洗4～5次，將種子表面的升汞沖洗干凈，接于MS培養基中，室內自然光光照培養，待種子萌發至2～3cm，取其下胚軸為外植體，切成0.5cm×0.5cm的小塊，轉接于 MS＋2.0mg/L 2，4－D＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂［11］誘導愈傷組織，時間為20～25d（圖1－1）。將愈傷組織轉接到前期分化培養基，誘導芽分化培養基為 MS＋6－BA 0.5mg/L＋NAA 0.05mg/L＋瓊脂0.9%［13］（圖1－2），直至分化出幼小再生苗。

30～35 d后選取健康無污染的幼小和田苜蓿再生苗接種在MS基本培養基上，設置不同濃度6－BA和NAA的組合、不同蔗糖含量、不同瓊脂濃度、不同光照強度作單因子處理，每個處理20株，每瓶5株，3次重復。培養條件：25～28℃，光照周期16h。

1.3 數據處理方法

在不同因素作用下，培養30d后，觀察并統計組培苗出現玻璃化的情況，用SPSS17.0軟件進行單因素的差異顯著性分析，并按公式計算：

2 結果與分析

2.1 6－BA和NAA濃度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在添加20g/L蔗糖，7g/L瓊脂的MS培養基中，添加不同濃度6－BA和NAA，在光照強度為1 000～1 200lx的條件下，接種繼代培養后的和田苜蓿再生苗，接種30d后觀察并統計結果（表1）。試驗發現，隨著6－BA和NAA濃度的升高，再生苗玻璃化率逐漸增大，當6－BA為2.0mg/L、NAA 為0.5mg/L時其增殖系數達到最大，為1.93，玻璃化率為38%；當6－BA為2.0mg/L、NAA 為1mg/L 時，其增殖系數為1.75，玻璃化率為60%（圖1－3），研究表明，隨著6－BA和NAA濃度的升高，和田苜蓿再生苗的玻璃化現象加重，而其再生苗增殖系數先升高后降低。綜合考慮，選擇2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA為和田苜蓿再生苗分化的最佳激素濃度配比。

2.2 蔗糖濃度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

將繼代培養的分化苗接種于添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA和7g/L的瓊脂的MS培養基中并附加不同濃度的蔗糖，在光照強度為1 000～1 200lx的條件下，培養30d后觀察統計結果（表2），隨著蔗糖濃度的增加，再生苗的玻璃化率逐漸降低，當蔗糖濃度為30g/L時，其玻璃化率最低，為17%；增殖系數在增大的情況下又減小，當蔗糖濃度為20g/L的時候，其增殖系數達到最大，為1.63。當蔗糖濃度為20g/L和25g/L時，其增殖芽數最多，增殖系數差異不顯著，并且玻璃化率比較低（圖1－4），所以當蔗糖濃度為20～25g/L時適合和田苜蓿再生苗的生長。

表1 不同激素濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 1 Effect of different hormones combination on vitrification of hetian alfalfa

表2 不同蔗糖濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 2 Effect of sugar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.3 瓊脂濃度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 和20 g/L蔗糖的MS培養基中加不同濃度的瓊脂，光照強度為1 000～1 200lx的條件下，接種繼代培養后的再生苗，30d后觀察。試驗結果發現，隨著瓊脂濃度的增大，其玻璃化率逐漸減小，當瓊脂濃度為5g/L時，再生苗玻璃化現象最嚴重（表3，圖1－5），玻璃化率達到78%。瓊脂濃度為7g/L和8g/L時，其增殖系數差異性顯著，玻璃化率差異性不顯著，因此，選擇7g/L的瓊脂濃度作為和田苜蓿最佳的再生苗分化濃度。

表3 不同瓊脂濃度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 3 Effect of agar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.4 光照強度對和田苜蓿再生苗玻璃化的影響

在含2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA＋20g/L蔗糖＋7g/L瓊脂的培養基上，接種繼代培養后的和田苜蓿再生苗，置于不同光照強度的培養箱進行培養，30d后觀察。結果表明，隨著光照強度增加，再生苗芽增殖能力先升高再下降，在光照強度為1 000lx時，增殖芽數最多，為25.67，其增殖系數最大；當光照強度為1 000lx和1 200lx時，其增殖系數差異性不顯著。當光照強度為1 000lx和1 200lx時，和田苜蓿玻璃化苗情況不嚴重，玻璃化率明顯低于其他2個光照強度（表4，圖1－6）。因此，選擇1 000～1 200lx的光照強度為和田苜蓿再生苗分化培養的光照強度。

表4 不同光照強度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 4 Effect of Light intensity on vitrification of hetian alfalfa

圖1 和田苜蓿再生狀況Fig.1 Regeneration of hetian alfalfa

3 討論

玻璃化苗現象普遍存在于組織培養過程中，試管苗玻璃化嚴重影響了植物組織培養的效率和質量，因此，試管苗玻璃化問題的解決有助于整個植物組織培養的發展和其遺傳體系的建立［14］。而且，在試管苗增殖過程中，一旦形成玻璃化苗，其增殖系數會明顯下降，不利于繼代和生根培養，降低了組培的效率［15］。在植物組織培養中，蔗糖一直被作為標準碳源，蔗糖的用量是組織培養成功與否的關鍵之一。成細華等［16］在結球白菜組織培養中發現，高濃度的蔗糖不僅不能克服玻璃化現象，而且抑制了不定芽的分化。因此，適當提高蔗糖濃度對培養壯苗很有必要［17］，何芳蘭等［18］認為，增加蔗糖和瓊脂的濃度，可以在不同程度上減少高山杜鵑試管苗玻璃化的發生，當瓊脂濃度0.6%時，其玻璃化率低，增殖系數高。研究通過蔗糖和瓊脂的不同濃度發現，在和田苜蓿的組織培養中，利用MS培養基，增加適宜濃度的瓊脂，可以降低培養基的襯質勢，造成細胞吸水阻遏，從而降低玻璃化。適當提高培養基中蔗糖含量，也可降低培養基中的滲透勢，減少培養基中植物材料可獲得的水分，降低玻璃化現象。

研究報道，玻璃化苗發生百分率和細胞分裂素成正相關，其中，6－BA的影響大于ZT和KT［19］。適當的激素組合可以降低試管苗的玻璃化。實驗研究中，在MS＋2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 的培養條件下，和田苜蓿玻璃化程度降低，所以，和田苜蓿組織培養可通過調整6－BA（2.0mg/L）和 NAA（0.5mg/L）的作用濃度，降低和田苜蓿的玻璃化現象，并且其再生芽增殖較明顯。研究建議今后這些措施可以應用于苜蓿組織培養過程中，消除玻璃化現象，提高苜蓿組織培養的效率。

在植物組織培養中，光照是影響培養效果的主要因子之一［20］。桂明春等［22］通過對橡膠樹不定芽誘導的研究發現，光照強度能顯著影響不定芽的生長和形態，不同光照強度下誘導出的不定芽嫩綠程度不同。研究發現，在和田苜蓿誘導分化階段，光照強度對不定芽的再生和植物葉片的形態具有顯著影響，當光照強度為1 000～1 200lx時，其不定芽嫩綠，玻璃化情況不嚴重。因此，不同的植物，選擇適宜的光照強度對組織培養體系的建立具有重要作用。

［1］顧壘，畢玉芬.轉基因苜蓿研究的現狀和前景［J］.草原與草坪，2004（1）：17－21.

［2］蘇加楷.中國牧草新品種選育的回顧與展望［J］.草原與草坪，2001（4）：3－8.

［3］王發生，李陽春，梁慧敏，等.紫花苜蓿愈傷組織誘導及植株再生的研究［J］.草原與草坪，2006（4）：55－58.

［4］卜學賢，陳維倫.試管植物的玻璃化現象［J］.植物生理學通訊，1987（5）：13－13.

［5］Debergh P，Aitken－cheristie J，Cohen D，et al.Reconsideration of the term ‘vitrification’as used micropropagation［J］.Plant Cell Tissue Organ Culture，1992，30（2）：135－140.

［6］Debergh P，Harbaoui Y，Lemeur R.Mass propagation of globe artichoke：Evaluation of different hypotheses to overcome vitrification with special reference to water potential［J］.Physiology Plantarum，1981，53（2）：181－187.

［7］陳兵先，黃寶靈，呂成群，等.植物組織培養試管苗玻璃化現象研究進展［J］.林業科技開發，2011，25（1）：1－5

［8］高國訓.植物組織培養中的褐變問題［J］.植物生理學通訊，1999，35（6）：501－506.

［9］陶銘.組織培養中畸形胚狀體及超度含水態苗的研究［J］.西北植物學報，2001，21（5）：1048－1058.

［10］李云霞，馬暉玲，成慧.紫花苜?；蜣D化組織再生過程中褐化因素的分析［J］.中國草地學報，2010，32（4）：69－74.

［11］吳麗芳，張鴨關.紫花苜蓿組織培養中常遇問題及對策［J］.草業與畜牧，2009（9）5－7.

［12］施莉娟，蒲小鵬，溫洋，等.種子消毒方法和激素處理對和田大葉紫花苜蓿植株再生的影響［J］.草原與草坪，2011，31（1）：54－57.

［13］李紅民，馬暉玲.玻璃化法超低溫保存匍匐翦股穎胚性愈傷組織及其植株再生［J］.甘肅農業大學學報，2009，44（4）：62－66.

［14］梁海曼，周菊華.試管苗玻璃現象的生理生化和機理探討［J］.武漢植物研究，1994（3）：280－288.

［15］蘇燕鈿，胡美蓉，郭曉玲，等.香蕉組培苗玻璃化現象成因之一培養基pH 值［J］.廣西熱帶農業，2005（3）：5－6.

［16］成細華，劉凡，曹鳴慶.結球白菜組培再生苗玻璃化問題初步研究［J］.首都師范大學學報（自然科學版），2001（9）：60－64.

［17］林盛，陳幸華.椰子胚離體培養中的蔗糖效應［J］.熱帶作物學報，1999，20（1）：20－24.

［18］何芳蘭，李毅，趙明，等.影響高山杜鵑試管苗玻璃化的幾個因素研究［J］.西北林學院學報，2008，23（1）：104－107.

［19］吳若菁，尤華明，彭東輝.香石竹組培苗玻璃化控制的研究［J］.福建林學院學報，1995，15（4）：360－363.

［20］沈海龍.樹木組織培養微體試管外生根育苗技術［M］.北京：中國林業出版社，2009：21－22.

［21］桂明春，梁國平，段安安.光照強度對橡膠樹不定芽誘導的影響［J］.熱帶農業科技，2011，34（4）：15－18.