影響草地早熟禾愈傷組織誘導和分化的相關因子研究

張媛媛，馬暉玲，俞 玲

（甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中－美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

草地早熟禾（Poa pratensis）是一種優質的冷季型草坪草，主要分布于我國北方地區，也是這一地區需求量最大的建坪草種之一。但草地早熟禾具有生長緩慢、抗病蟲害能力弱、耐高溫和抗旱能力較差，在高溫干旱的環境下葉片容易干枯變黃等缺點［1，2］。而草地早熟禾的一些改良品種，如午夜2號（MidnightⅡ）、新哥來德（Nuglade）、橄欖球2號（RugbyⅡ）等具有優良特性。其中，午夜2號的特點為綠期長、耐低修剪、抗旱耐寒性強、耐熱耐陰性高、耐踐踏、綜合抗病力好；新格萊德耐熱耐陰力出眾、抗病性能高、植株低矮［3］；橄欖球2號抗寒旱能力強，綠期長、返青好、抗病蟲害能力強［4，5］。草地早熟禾的3個品種的綜合評價較高，是目前草坪建植中優先選擇的優異品種，同時也是良好的育種親本材料。以草地早熟禾午夜2號、新格萊德和橄欖球2號為材料，進行愈傷組織誘導和植株再生的研究，為草地早熟禾的品種改良和新品種選育奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料由北京克勞沃集團提供的草地早熟禾午夜2號、新格萊德和橄欖球2號3個品種的成熟種子為供試材料。

培養基所用的無機鹽、蔗糖以及瓊脂為國產分析純；各種維生素和激素購自上海生工生物有限公司，實驗用水均為蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 外植體處理 取每個品種的成熟種子適量，分成兩份浸泡于清水，分別放置于4℃冰箱和25±1℃恒溫培養箱中，處理時間分別為8、16和24h，取出后用清水沖去漂浮的干癟種子并用紗布包裹，然后在超凈工作臺上先后用70%酒精和0.1%升汞溶液消毒2～10min，無菌水沖洗3～5次，放置在雙層無菌濾紙上吸干水分［6］。

1.2.2 愈傷組織誘導和繼代培養 將滅菌后的種子按每皿50粒接種于MS誘導培養基，置于25±1℃、黑暗條件下進行愈傷組織的誘導；6周后，將愈傷組織轉接到繼代培養基上，每15d繼代1次［18］。附加的激素成分及含量見表1。

1.2.3 分化和植株再生 選取不同繼代次數且胚性較好的愈傷組織接種到分化培養基（表1），置于人工氣候箱培養，溫度為25±1℃，16h光照，8h黑暗，光照強度為2 000lx。

1.3 統計與分析

（1）記錄不同處理條件下種子由萌動到發芽再到愈傷組織形成的時間，計算平均出愈時間。

（2）接種約6周（第1次繼代前），統計各品種不同處理條件下的總愈傷組織塊數，計算出愈率。

表1 培養基激素含量Table 1 Hormone levels in the culture medium mg/L

（3）愈傷組織轉移到分化培養基20d后，統計分化的綠芽數，并計算綠芽率。

（4）愈傷組織轉接到分化培養基40d后，記錄成苗數，并計算成苗率。

2 結果與分析

實驗做了2種溫度和3個浸種時間的預處理。不同條件處理的草地早熟禾成熟種子的誘導，愈傷組織在出愈時間和出愈率等方面有明顯差異，而分化和再生過程差異不大（圖1）。

圖1 4種愈傷組織生長狀況Fig.1 A Callus induced；B Callus sub－culture；C Green shoot－buds；D Plantlets differentiated

2.1 不同處理對草地早熟禾種子出愈時間的影響

浸種時間相同，4℃下浸種較25℃下浸種，各品種的出愈時間顯著縮短。而浸種溫度相同條件下，各品種浸種8h較浸種16h和24h的出愈時間顯著增加，而16h和24h間差異不顯著（表2）。實驗中，在25℃下浸種16h和24h，各品種4～5d萌動，7～8d發芽，平均26.26～38.79d形成愈傷組織，而在4℃下浸種16h和24h，進程明顯提前，在16.27～28.95 d即形成愈傷組織，說明對草地早熟禾種子進行低溫預處理能加快出愈時間，最佳浸種時間16～24h。

2.2 不同處理對草地早熟禾出愈率的影響

相同時間4℃較25℃浸種，各品種愈傷組織誘導率均有所提高（表4），在浸種16h和24h時，這2個溫度處理的差異呈顯著水平；相同溫度條件下浸種8h的愈傷組織誘導率均明顯低于16～24h。表明4℃浸種有利于提高草地早熟禾愈傷組織的誘導率，但浸種時間過短則不利于誘導愈傷組織。午夜2號浸種16～24h的愈傷組織誘導率略高，說明4℃下浸種16h有利于午夜2號愈傷組織誘導。新格萊德和橄欖球2號在4℃下浸種24h的愈傷組織誘導率比浸種16h略高，結合二者在此條件下的平均出愈時間，說明4℃下浸種24h有利于愈傷組織誘導。

2.3 繼代次數對草地早熟禾愈傷組織分化的影響

分別選取繼代1～6次，外表干燥、致密、呈顆粒狀的愈傷組織接種到分化培養基上，每10d繼代1次。約20d愈傷組織出現綠色芽點，40d形成綠苗（圖2）。隨著繼代次數的增加，草地早熟禾愈傷組織的分化能力逐漸下降。午夜2號和橄欖球2號繼代1次的愈傷組織分化能力最高，繼代次數增加，分化率明顯降低；新格萊德繼代2次的愈傷組織有較強的組織分化能力，隨后愈傷組織分化能力急劇下降。結果顯示，草地早熟禾繼代培養時間越長越不利于愈傷組織的分化，培養30d以內的愈傷組織胚性較好，分化能力強，繼代培養60d以后的愈傷組織分化率明顯降低，基本喪失分化能力。

圖2 繼代培養次數草地早熟禾愈傷組織的分化Fig.2 Effect of Sub－culture on the callus differentiation of Poa pretensis

3 討論與結論

3.1 低溫處理對草地早熟禾愈傷組織誘導的影響

關于低溫預處理對愈傷組織誘導的影響，國內外學者的研究結果不盡相同。劉萍等［7］和廖祥儒等［8］在研究中發現，低溫處理能夠促進小麥成熟胚愈傷組織的形成；但曹原等［9］在研究中指出，低溫預處理對愈傷組織形成率的影響取決于植物體的品種；賀杰等［10］在研究中報道，盡管低溫預處理對不同小麥品種愈傷組織誘導率的促進效應在不同基因型間存在差異，但低溫預處理有益于多數品種進行愈傷組織誘導；1984年McDonnell和Conger［11］的研究表明，種子在4℃下進行低溫預處理可以有效提高肯塔基種子誘導愈傷組織的能力。此次研究發現，4℃低溫預處理對3個供試草地早熟禾品種愈傷組織的誘導均有促進作用，加快了愈傷組織的形成并提高了愈傷組織的誘導率，可能是低溫處理打破種子休眠，提高種子萌發率，從而提高了其愈傷組織誘導率。因此，低溫預處理可以廣泛用來改善草地早熟禾種子愈傷組織形成。

3.2 浸種時間對草地早熟禾愈傷組織誘導的影響

在對日本結縷草進行研究的結果表明，用水浸泡處理和綜合處理的方法可以快速有效地促進日本結縷草成熟種子發芽，并且指出最佳浸泡時間為72h，但隨著浸泡時間延長，種子萌發率降低，愈傷組織誘導率也相應下降［12，13］；賀杰等［10］以小麥種子作為供試材料，研究了不同浸種時間對種子出愈率的影響，結果顯示，16h為最佳浸種時間，同時還指出不同品種應采取不同浸種時間。試驗發現，浸種8h的種子仍然較硬，很難剝離胚，不利于種子的萌發，愈傷組織誘導率也處于較低水平；浸種16～24h的種子胚易剝離，種子萌發率升高，有利于愈傷組織的形成。

3.3 繼代培養時間對草地早熟禾再生的影響

對不同基因型早熟禾組織培養和植株再生的研究表明，早熟禾愈傷組織的繼代時間對其分化影響較大，隨著愈傷組織繼代培養時間的增加，其再分化能力顯著下降［11，14］，培養超過3個月的愈傷組織基本喪失分化能力［15］。Ke等［14］研究結果表明，植株再生能力與愈傷組織的生長狀態有關，顏色鮮黃、表面干燥、顆粒狀，生長迅速的愈傷組織為胚性愈傷組織，Armstrong［16］，佘建明等［17］認為選擇胚性較好的愈傷組織有利于克服繼代培養時間對再生能力產生的不良影響。研究結果顯示，繼代1～2次的愈傷組織保持較高分化能力，繼代3次后愈傷組織分化能力明顯降低，甚至喪失分化能力；不同基因型之間差異顯著，午夜2號和橄欖球2號繼代1次的愈傷組織分化能力最強，而新格萊德繼代2次的分化率明顯高于其他培養時間。

以草地早熟禾3個品種的成熟種子作為外植體，對種子作溫度及浸種處理，進行愈傷組織的誘導，結果表明4℃浸種16～24h可以促進愈傷組織形成，不同品種差異不明顯；對3個品種進行分化培養，午夜2號、橄欖球2號繼代1次的愈傷組織胚性最好，分化能力強，新格萊德繼代2次的胚性愈傷組織分化率最高。為了提高草地早熟禾愈傷組織誘導率并加快出愈時間，對種子應做4℃低溫預處理，并且浸泡16～24h為宜；愈傷組織胚性的保持是進行植株再生的關鍵，因此，應挑選生長狀態最好的愈傷組織進行植株再生，此次實驗午夜2號和橄欖球2號繼代培養15d、新格萊德繼代培養30d。

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