吡咯烷二硫代氨基甲酸酯減輕2型糖尿病大鼠胰島β細胞氧化損傷

丁海燕，趙瑞景，尹小妹，劉桂紅，劉建坤，朱鐵年*

（1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院腫瘤科，河北石家莊 050082;2.河北醫科大學內科學教研室，河北石家莊 050017;3.河北醫科大學免疫學教研室，河北石家莊 050017）

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯減輕2型糖尿病大鼠胰島β細胞氧化損傷

丁海燕1，2，趙瑞景3，尹小妹1，劉桂紅1，劉建坤1，朱鐵年1*

（1.中國人民解放軍白求恩國際和平醫院腫瘤科，河北石家莊 050082;2.河北醫科大學內科學教研室，河北石家莊 050017;3.河北醫科大學免疫學教研室，河北石家莊 050017）

目的 探討吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）對2型糖尿病大鼠胰島β細胞氧化損傷的影響及其機制。方法 用長期高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素（STZ，27 mg/kg）建立2型糖尿病大鼠模型。PDTC治療組大鼠每天腹腔注射PDTC（50 mg/kg）1次，1周后取血漿檢測血糖。取胰腺組織勻漿測定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的含量;應用免疫組化和Western blot等檢測胰腺組織中誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的表達及硝基化酪氨酸（NT）的水平;流式細胞術檢測胰島β細胞凋亡百分率。結果 糖尿病大鼠血糖、MDA水平均顯著高于對照組（P＜0.01）;SOD和GSH-PX水平明顯低于對照組（P＜0.01）;胰島組織中iNOS表達水平（0.37±0.06）和NT生成量（0.24±0.01）均較對照組（0.11±0.01）和（0.12±0.01）明顯增多（P＜0.01）。PDTC治療后血糖明顯降低，MDA明顯減少（P＜0.01）;而SOD、GSH-PX水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）;胰島組織中iNOS表達及NT生成均明顯減少（P＜0.01）;胰島β細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。結論 PDTC可以減輕大鼠體內氧化應激反應，減少糖尿病大鼠胰島β細胞的凋亡。

PDTC;糖尿病;氧化損傷;胰島β細胞;凋亡

*通信作者（corresponding author）:zhutienian@medmail.com.cn

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是以慢性高血糖為主要特征的代謝性疾病。由于體內氧化和抗氧化作用失衡引起氧化應激導致胰島β細胞數量減少是糖尿病發生發展的一個重要機制，其中胰島β細胞凋亡異常增多是導致胰島β細胞數量減少的重要原因［1－2］。本實驗旨在通過高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素（STZ）建立2型糖尿病模型，觀察胰腺組織氧化應激指標的變化，探討PDTC抑制胰島β細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:清潔級雄性Wistar大鼠37只，體質量180～210 g［河北醫科大學動物中心，許可證號（冀）2008-1-003］。

1.1.2 主要試劑:吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）、鏈脲佐菌素（STZ）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）和丙烯酰胺（Acrylamide）（Sigma公司）;超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）測定試劑盒和丙二醛（MDA）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）;Rabbit Anti-iNOS IgG多克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記驢抗兔IgG（Santa Cruz公司）;PV6001試劑盒、PV6002試劑盒、DAB染色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）;Rabbit Anti-β-Tubulin抗體（北京博奧森生物技術有限公司）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.2 方法

1.2.1 T2DM大鼠模型的建立:參照 Reed等［3］方法建立T2DM大鼠模型。37只雄性Wistar大鼠，適應性喂養1周后隨機分為2組:對照組（control）12只，給予普通飲食喂養;高脂飲食組25只，給予高脂飲食喂養，脂肪供能占總熱量的42%。每周檢測大鼠的體質量及血糖變化。喂養8周后，高脂飲食組通過口服葡萄糖耐量實驗（OGTT）和胰島素敏感性實驗證實產生胰島素抵抗后，過夜禁食12 h，給予STZ（27 mg/kg）一次性腹腔注射，3 d后隨機血糖≥16.7 mmol/L者為T2DM模型成功。將成模大鼠隨機分為糖尿病組（DM）和PDTC治療組（PDTC）各12只，PDTC組大鼠每日腹腔注射PDTC 50 mg/kg，對照組和糖尿病組大鼠每日給予同體積的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，連續注射1周后，處死各組大鼠，留取血漿及胰腺組織用于后續指標檢測。

1.2.2 血糖測定:采用葡萄糖氧化酶法測定血糖。

1.2.3 胰腺組織氧化損傷指標的測定:按照試劑盒說明采用硫代巴比妥酸（TBA）微量法測定MDA含量;黃嘌呤氧化酶法測定 SOD活性;比色法測定GSH-PX活性。

1.2.4 胰島β細胞凋亡檢測:胰腺組織經70%乙醇固定后，搓網法制備單細胞懸液，經Insulin-FITC聯合碘化丙啶（PI）染色后，用流式細胞儀檢測胰島β細胞凋亡百分率。實驗管加anti-Insulin-FITC和PI，同時設加lgG-FITC和PI的同型對照管。anti-Insulin-FITC陽性者為分泌胰島素的胰島細胞，PI陽性者為凋亡的細胞。anti-Insulin-FITC和PI雙陽性者為凋亡的胰島β細胞。

1.2.5 HE染色觀察大鼠胰腺組織病理學改變:各組大鼠胰腺組織分別進行石蠟切片，常規HE染色，在光鏡下觀察胰腺組織形態學變化。

1.2.6 免疫組化觀察大鼠胰腺組織內iNOS表達及NT的生成:取各組大鼠胰腺組織進行石蠟包埋、切片，行iNOS和NT免疫組化染色觀察iNOS的表達和NT的生成。

1.2.7 Western blot測定各組大鼠胰腺組織中iNOS的表達水平:冰上稱取100 mg胰腺組織加入液氮，在預冷的研缽中研碎，加500 μL RIPA裂解液（25 mmol/L Hepes，134 mmol/L NaCl，1%NP-40，0.1%SDS，1 mmol/L釩酸鹽，0.5%脫氧膽酸鈉，100 mmol/L NaF）提取組織蛋白。蛋白定量后與上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，每份樣品取40 μg蛋白上樣，經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并將其轉移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h后，加入兔抗iNOS一抗（1∶500稀釋），4℃孵育過夜。經HRP標記的驢抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育1.5 h，加入ECL發光底物，壓X線膠片，曝光顯影，應用Image J圖像分析系統對蛋白條帶進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠空腹血糖比較

DM組大鼠空腹血糖為（26.55±2.90）mmol/L，明顯高于對照組的（5.58±0.43）mmol/L（P＜0.01）;PDTC治療1周后，PDTC治療組大鼠空腹血糖為（11.55±2.89）mmol/L，明顯低于DM組（P＜0.01），但仍高于對照組（P＜0.05）。

2.2 胰腺組織內氧化應激指標變化

糖尿病組SOD、GSH-PX活力明顯低于對照組（P＜0.01），PDTC治療后明顯回升（P＜0.01或P＜0.05）。糖尿病組 MDA含量明顯高于對照組（P＜0.01），PDTC治療后明顯回降（P＜0.01）（表1）。

表1 各組胰腺組織內SOD、GSH-PX、MDA含量比較Table 1 Comparison of SOD，GSH-PX and MDA contents in pancreatic tissue in each group（ ± s，n=12）

表1 各組胰腺組織內SOD、GSH-PX、MDA含量比較Table 1 Comparison of SOD，GSH-PX and MDA contents in pancreatic tissue in each group（ ± s，n=12）

*P＜0.01 compared with control group;#P＜0.05，##P＜0.0 1 compared with DM group.

group SOD（U/mg·prot）GSH-PX（unit of activity）MDA（nmol/mg·prot）control 71.50±3.20 68.11±5.0 1.08±0.10 DM 50.90±6.84* 48.60±2.0* 3.44±0.33*PDTC 61.40±4.94## 54.10±4.10# 2.14±0.13##

2.3 各組胰島β細胞凋亡率

糖尿病組胰島β細胞凋亡率為22.44%±5.15%，明顯高于對照組的10.35% ±1.95%（P＜0.01）;PDTC治療組β細胞凋亡率為12.14%±4.66%，明顯低于DM組（P＜0.05）（圖1）。

2.4 胰腺組織病理學變化

正常對照組胰島內細胞數量較多，排列整齊，大小一致，分布均勻。糖尿病組胰島內細胞數量明顯減少，分布稀疏，形狀不規則，排列紊亂，可見空泡樣變。PDTC治療后胰島形態較糖尿病組胰島內細胞明顯增多，細胞結構明顯改善（圖2）。

圖1 流式細胞術檢測胰島β細胞凋亡Fig 1 Pancreatic islet cell apoptosis detected by flow cytometry

圖2 各組大鼠胰腺組織HE染色及免疫組化結果Fig 2 The HE and immunohistochemical staining results in different groups（×400）

2.5 iNOS、NT免疫組化染色結果

糖尿病組大鼠胰島β細胞胞質中呈強陽性反應，陽性信號呈棕褐色;對照組大鼠胰腺組織中僅見較弱的iNOS、NT陽性反應信號;PDTC組大鼠胰腺組織iNOS、NT陽性反應細胞較糖尿病組明顯減少（P＜0.01）（圖2，3，4）。

2.6 Western blot測定iNOS表達

各組均可見到特異性iNOS蛋白條帶。糖尿病組大鼠胰腺組織中iNOS的水平明顯高于正常對照組;PDTC治療后胰腺組織中iNOS表達顯著降低（P＜0.05）（圖5）。

3 討論

圖3 各組大鼠胰腺組織iNOS的表達Fig 3 The expression of iNOS protein in different groups（n=6）

目前糖尿病在各種慢性病病死率中僅位居心腦血管疾病之后，伴隨著人口老齡化及肥胖人數的增加，2型糖尿病發病率日益增多。2型糖尿病是在遺傳背景基礎上，由多種后天因素綜合作用而引起，其病理基礎為胰島β細胞功能受損和胰島素抵抗［4］。2型糖尿病發病過程中，高血糖及高血脂引起的氧化應激是導致胰島β細胞損傷的重要原因［5］，控制血糖，減輕氧化應激可以減緩2型糖尿病的發展，因此，進一步闡明氧化應激引起胰島β細胞損傷的機制，應用具有抗氧化作用的藥物對2型糖尿病的控制具有重要意義。

氧化應激可在各種組織中發生，但由于胰島β細胞的SOD和GSH-PX等抗氧化酶表達量低，若體內自由基過多可使其耗竭，因此β細胞特別容易受到氧化應激的損害［6］。已有研究證實，在高糖和高脂肪酸的刺激下，線粒體可產生大量活性氧簇（ROS）引起氧化應激，激活轉錄因子NF-kB，增加iNOS的轉錄和表達，使NO產生增加，過量的NO與超氧陰離子結合后可生成氧化作用更強的過氧亞硝基陰離子 （Peroxynitrite，ONOO－），引起 DNA氧化斷裂，導致細胞凋亡［7］。ONOO－很不穩定，不易檢測，但因其可使蛋白質酪氨酸殘基或游離酪氨酸發生硝基化反應，形成最終產物硝基酪氨酸（Nitrotyrosine，NT）［8］。因此，可通過檢測 NT的生成量間接反映ONOO－的產生水平。

本研究通過檢測2型糖尿病大鼠胰島β細胞的凋亡及胰腺組織中iNOS的表達和NT的生成，初步探討了氧化應激引起胰島β細胞凋亡的可能機制以及NF-κB抑制劑PDTC對2型糖尿病胰島β細胞凋亡的抑制作用。結果發現，糖尿病大鼠胰腺組織中SOD、GSH-PX活性減低，MDA產量升高，表明糖尿病大鼠胰腺組織中氧化、抗氧化平衡嚴重失調，處于氧化應激狀態。PDTC治療后大鼠胰腺組織內SOD、GSH-PX含量明顯回升，MDA含量下降，表明PDTC具有抗氧化，清除自由基和脂質過氧化物作用，進而保護胰島β細胞。

大量研究已表明，抗氧化劑對胰島β細胞的功能具有保護作用［9－11］。本實驗結果同樣證實了PDTC可通過抑制NF-κB的活化，降低iNOS的表達，抑制NO及ONOO－的產生，最終減輕氧化應激誘導的胰島β細胞凋亡，因此，PDTC有望成為治療糖尿病的新一代藥物。

［1］Kaneto H，Kawamori D，Matsuoka TA，et al.Oxidative stress and pancreatic beta-cell dysfunction［J］.Am J Ther，2005，12:529－33.

［2］Chen J，Saxena G，Mungrue IN，et al.Thioredoxin-interacting protein:a critical link between glucose toxicity and beta-cell apoptosis［J］.Diabetes，2008，57:938 －944.

［3］Reed MJ，Meszaros K，Entes LJ，et al.A New Rat Model of Type 2 Diabetes:The Fat-Fed，Streptozotocin-Treated Rat［J］.Metabolism，2000，49:1390 －1394.

［4］ Andrikopoulos S.Obesity and Type 2 diabetes:Slow down!-Can metabolic deceleration protect the islet beta cell from excess nutrient-induced damage?［J］.Molecular and Cellular Endocrinology，2010，316:140－146.

［5］Leibowitz G，Bachar E，Shaked E，et al.Glucose regulation of β-cell stress in type 2 diabetes［J］.Diabetes，Obesity and Metabolism，2010，12:66－75.

［6］Lenzen S.Oxidative stress:the vulnerable beta-cell［J］.Biochem Soc Trans，2008，36:343－347.

［7］Kaneto H，Katakami N，Matsuhisa M，et al.Role of reactive oxygen species in the progression of type 2 diabetes and atherosclerosis［J］.Mediators Inflamm，2010:453892.

［8］Drel VR，Pacher P，Stevens MJ，et al.Aldose reductase inhibition counteracts nitrosative stress and poly（ADP-ribose）polymerase activation in diabetic rat kidney and highglucose-exposed human mesangial cells［J］.Free Radic Biol Med，2006，40:1454－1465.

［9］Chan JY，Lam FC，Leung PC，et al.Antihyperglycemic and antioxidative effects of a herbal formulation of radix astragali，radix codonopsis and cortex lycii in a mouse model of type 2 diabetes mellitus［J］.Phytother Res，2009，23:658－665.

［10］Palsamy P，Subramanian S.Ameliorative potential of resveratrol on proinflammatory cytokines，hyperglycemia mediated oxidative stress，and pancreatic β-cell dysfunction in streptozotocin-nicotinamide-induced diabetic rats［J］.J Cell Physiol，2010，224:423 －432.

［11］Robertson RP.Antioxidant drugs for treating beta-cell oxidative stress in type 2 diabetes:glucose-centric versus insulin-centric therapy［J］.Discov Med，2010，9:132 －137.

Pyrrolidine dithiocarbamate attenuates pancreatic β-cell oxidative injury in type 2 diabetic rats

DING Hai-yan1，2，ZHAO Riu-jing3，YIN Xiao-mei1，LIU Gui-hong1，LIU Jian-kun1，ZHU Tie-nian1*

（1.Dept.of Medical Oncology，Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050082;2.Dept.of Internal Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017;3.Dept.of Immunology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC）on islet β cell oxidative injury in type 2 diabetic rats.MethodsType 2 diabetic rat model was set up by long-term feeding high-fat foods accompanied with a single intraperitoneal injection of low dose of streptozotocin（STZ，27 mg/kg body weight）.The rats in PDTC group were administerd with PDTC（50 mg/kg·d）by intraperitoneal injection.After treatment for 1 week，blood glucose levels were estimated.Malondialdehyde（MDA），Superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-PX）content in pancreatic tissue was measured.The expression of induc ible nitric oxide synthase（iNOS）and the prouduction of nitrotyrosine（NT）in islet tissue were examined by using immunohistochemistry and Western blot.The rate of pancreatic islet β cell apoptosis was detected by flow cytometry.ResultsThe blood glucose level，MDA content，pancreatic β-cell apoptosis，iNOS expression and NT production were significantly higher，while the SOD and GSH-PX activities were significantly lower in DM group than those in normal control group（P＜0.01）.After administration of PDTC，The level of blood glucose，MDA content，pancreatic β-cell apoptosis，iNOS expression and NT production were significantly decreased，while the SOD and GSH-PX activities were markedly increased when compared with DM group（P＜0.01）.ConclusionsPDTC can relieve the oxidative stress reaction of diabetic rats，suppress the expression of iNOS and NT production，and decrease pancreatic islet β cell apoptosis in diabetic rats.

pyrrolidine dithiocarbamate;diabetes;oxidative injury;pancreatic islet β cell;apoptosis

R 587.1

A

1001-6325（2012）01-0036-06

2010－12－27

2011－06－27

河北省自然科學基金（C2009001232）;河北省科技支撐計劃項目（10276105D－66）;河北省衛生廳資助項目（20090168）;國家人事部留學人員科技活動項目擇優資助項目（2008）

book=41,ebook=94