布地奈德對哮喘小鼠JAK1及IL-4表達的影響

李 惠 鄒立華 陳小丹 謝麗華

廣東省深圳市龍崗區人民醫院呼吸科，廣東深圳 518172

支氣管哮喘是一種常見病，是各類炎癥細胞及其分泌的細胞因子、炎癥介質共同作用的結果，酪氨酸激酶信號傳導途徑在此起重要作用[1]。吸入糖皮質激素對于減輕哮喘癥狀及氣道炎癥是十分有效的，但其作用機制尚未完全明了。本研究旨在觀察布地奈德（Budesonide，BUD）對哮喘小鼠酪氨酸激酶信號傳導途徑中JAK1及白細胞介素-4（interleukin 4，IL-4）表達的影響，希望從分子水平探討糖皮質激素的作用機制，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

布地奈德購自阿斯利康公司，抗JAK1多克隆抗體購自Santa Cruz公司，雞卵白蛋白（OVA，Sigma），IL-4 及 IgE 試劑盒購自深圳晶美生物制品公司，其余試劑均為市售分析純試劑。健康雄性小鼠30只（廣東醫學院實驗動物中心提供，清潔級），6～8 周齡，體重 20～25 g，隨機分成 3 組，每組 10 只，按報道的方法復制及處死模型[2]：①對照組（A組）：抗原混合液為氫氧化鋁和生理鹽水。②哮喘模型組（B組）：抗原混合液為氫氧化鋁和OVA。③布地奈德干預組（C組）：激發時加用BUD混懸液霧化吸入，吸入時間與激發時間相等。

1.2 方法

1.2.1 EOS及Ig E檢測 用磷酸鹽緩沖液1 mL灌洗雙肺1次，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），行嗜酸性粒細胞（EOS）計數，采用酶聯免疫吸附法測定IgE水平。

1.2.2 肺組織勻漿IL-4測定 取0.1 g肺組織解凍后，勻漿，離心取上清液，用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法測定IL-4。

1.2.3 肺組織蛋白質酪氨酸蛋白激酶JAK1表達的檢測 肺組織解凍后取0.1 g放入含蛋白抽提液的勻漿器中，置于冰上勻漿后，放置 30 min，4℃下 12 000 r/min離心 5 min；取上清液，測定蛋白質含量。參照羅卿等[3]方法測定JAK1的表達。

1.3 統計學方法

用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，多組樣本間兩兩比較用q檢驗，各指標間行直線相關性分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癥狀觀察

激發約10 min 后B組小鼠開始出現鼻煽、呼吸加快加深、大小便失禁、抽搐等，提示引喘成功。A組未見哮喘癥狀。C組小鼠霧化吸入布地奈德后的前3天出現鼻煽、呼吸加快加深，偶有抽搐現象，第4天開始這些癥狀明顯減少，只有一只小鼠在第4天出現抽搐現象。

2.2 小鼠BALF中EOS計數及IgE水平

B組EOS計數及IgE水平均較A組高 （均P＜0.01），C組EOS計數及IgE水平均較B組低（均P＜0.05）。見表1。

表1 小鼠BALF中IgE水平及嗜酸性粒細胞計數（x±s）

2.3 肺組織IL-4、JAK1的表達及相關性

B組小鼠IL-4及JAK1表達均較A組高（均P＜0.01）；C組小鼠IL-4及JAK1表達均較B組低（均P＜0.05），見表2。相關性分析顯示，JAK1的表達與IL-4的濃度呈正相關（r=0.724，P ＜ 0.01）。

表2 各組肺組織IL-4、JAK1的表達（x±s）

3 討論

支氣管哮喘是慢性氣道炎癥性疾病，氣道反應性增加，其中一個重要特征是存在激活的Th2淋巴細胞、EOS和肥大細胞[4]。這種Th2細胞在合成IgE時激活結合IgE的細胞。IL-4是Th2細胞分泌的細胞因子，不僅促進Th2細胞的分化，同時抑制Th1細胞的增殖。本研究發現哮喘小鼠IL-4濃度及IgE含量、EOS計數升高，說明它們參與哮喘的氣道炎癥，與相關報道[5]一致。

JAK（Janus kinase）是一類非受體型蛋白酪氨酸激酶，位于胞漿中，其家族成員有JAK1、JAK2、TYK2和JAK3。部分生長因子、白細胞介素、干擾素等細胞因子與其受體結合后，激活了與受體關聯的JAKs家族，從而促使相應的信號轉導子和轉錄激動子 （signal transductors and activator of transcription，STAT）磷酸化后轉移到細胞核，與GAS增強子家族成員結合，完成相關基因的表達。JAKs-STAT途徑最先在干擾素信號傳遞研究中發現，隨后的大量研究發現該途徑還參與了哮喘發病機制中許多細胞因子的信號轉導[6]。IL-4、IL-13、IL-5等是參與哮喘發作的重要的細胞因子[7-9]。本研究中哮喘小鼠IL-4的表達明顯升高，且與JAK1濃度呈正相關。表明IL-4和JAKs-STAT途徑與哮喘密切相關。

吸入性糖皮質激素是當前防治哮喘的一線藥物。布地奈德是新合成的表面皮質激素，較地塞米松具有更高的親脂性，易穿過細胞膜與細胞漿內的糖皮質激素受體結合，局部抗炎活性強于地塞米松幾百倍[10]。國內研究結果提示BUD可能通過下調JAK1和STAT6的表達，從而抑制了依賴于JAK1／STAT6通路的氣道重塑[11]。本研究結果顯示BUD干預組小鼠哮喘癥狀緩解，小鼠BALF中IgE含量及EOS計數較哮喘模型組減少，肺組織中IL-4、JAK1的表達低于哮喘模型組，說明BUD能有效控制哮喘癥狀，減輕氣道炎癥，可能與抑制IL-4的水平、下調JAK1的表達，進而抑制Th0向Th2細胞的分化增殖有關。

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