HPLC法測定復方α酮酸片中四種氨基酸的含量

蔣 燕 陸繼好

1.無錫衛生高等職業技術學校，江蘇無錫 214111；2.無錫信孚醫藥技術有限公司，江蘇無錫 214028

復方α-酮酸是2000年和2004年國家醫保目錄品種以及國家基本藥物（2004年），臨床應用于慢性腎衰患者的營養，延緩腎衰進展，糾正代謝紊亂，復方α-酮酸的口號是：撥慢腎衰進展的時鐘。它由4種酮酸、1種羥酸和5種必需氨基酸配方制成，其中酮酸和羥酸以鈣鹽形式存在。酮酸或羥酸經過酶的轉氨基作用合成相應的必需氨基酸，同時尿素氮被降減，通過再利用含氮代謝產物減少尿毒癥毒素的蓄積，改善尿毒癥癥狀；通過腎小球的高濾過，降低血磷和PTH水平延緩慢性腎衰的進程，從而推遲開始透析的時間；補充必需氨基酸則糾正基酸代謝紊亂，改善營養狀況[1]。復方α-酮酸片中5種氨基酸除色氨酸外其他均無紫外吸收的特征，文獻資料大多采用柱前衍生法，以鄰苯二甲醛（OPA）和2-巰基乙醇為衍生化試劑，室溫堿性條件下（PH約9.5）迅速產生本品的一級氨基酸反應，生成具有強熒光的產物1-硫代-2-烷基-異吲哚（紫外波長 335 nm，熒光波長 λEx=340 nm，λEm=450 nm）[2-10]。文獻方法有5種氨基酸一次性測定方法，由于5種氨基酸的極性相差較大，此方法無法兼顧所有峰的峰形，易產生較大的測量誤差，參照高效液相色譜法（《中國藥典》2005年版二部附錄ⅤD），選用最常用的紫外檢測器測定含量，建立4種氨基酸的HPLC測定方法，經方法學研究，該方法準確方便，適合復方α-酮酸片中氨基酸的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀 （日本島津公司）：SPD-10AVP紫外檢測器；LC 10ATVP梯度泵，AT-130柱溫箱。

1.2 樣品

復方-α 酮酸片（開同片），批號：20060701、20060702、200 60703，江蘇信孚藥業有限公司；對照品：蘇氨酸（Thr）、組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）、醋酸賴氨酸（Lys-HAc）的含量均不少于99.0%。

1.3 試劑

乙腈為色譜純；無水醋酸鈉、冰醋酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、鄰苯二甲醛（OPA）和2-巰基乙醇為分析純；水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 衍生化試劑的制備

精密稱取鄰苯二甲醛（OPA）0.025 g，用甲醇1 mL溶解，加 2-巰基乙醇 100μL，0.4 mol/L硼酸溶液（PH 9.5，用氫氧化鈉溶液調節）定容至10 mL（當天配制）。

2.2 流動相的選擇

選擇資料RP-HPLC梯度洗脫，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，經試驗，發現各氨基酸的分離較差。然后改用乙睛-0.05 mol/L的醋酸鈉緩沖液二元流動相梯度洗脫，此時除色氨酸外其他4個氨基酸的峰形好，4個峰均能被很好的分離，保留時間適中，柱效好。

2.3 色譜條件

儀器：LC-10ATVP液相色譜儀 （日本島津）SPD-10AVP紫外檢測器（日本島津）N-2000雙通道色譜工作站（浙江大學智能信息工程研究所）；色譜柱：Lichrospher C18（25 cm×4.6 mm）；檢測波長：335 nm；進樣量：20 μL；柱溫：30℃；流動相：A液為乙腈（100%），B液為0.05 mol/L的醋酸鈉（冰醋酸調節PH為4.5）。梯度洗脫色譜條件見表1。

表1 梯度洗脫色譜條件

2.4 衍生化反應的條件

2.4.1 衍生化試劑的加入量 精密稱取對照品適量，用水溶解稀釋至每毫升含賴氨酸醋酸鹽約105μg/mL，蘇氨酸約53μg/mL，組氨酸約38μg/mL，酪氨酸約30μg/mL的溶液，作為對照品溶液。分別精密量取衍生化試液與對照品溶液（1∶1、1∶2、1∶3）反應，分別取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。經試驗，結果表明：衍生化試液與對照品溶液1∶1反應，衍生劑影響干擾較大；衍生化試液與對照品溶液1∶3反應，反應不完全；衍生化試液與對照品溶液1∶2反應，濃度適中，反應較完全，故確定樣品溶液與衍生化試液的衍生比例為2∶1。

2.4.2 衍生物的定性 分別取賴氨酸醋酸鹽、蘇氨酸、組氨酸、酪氨酸適量，分別用水溶液稀釋制成約含105、53、38、30μg/mL的溶液，衍生量同上，各吸取20μL分別注入色譜儀，對每個峰進行定性。出峰順序依次為：組氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和賴氨酸醋酸鹽。

2.4.3 衍生物的反應時間 精密稱取對照品適量，用水溶解稀釋至每毫升含賴氨酸醋酸鹽約105μg/mL，蘇氨酸約53μg/mL，組氨酸約38μg/mL，酪氨酸約30μg/mL的溶液，作為對照品溶液。精密量取對照品溶液400μL與衍生化試液200μL在室溫下分別反應2、3、4、5、10 min后測定各氨基酸的峰面積，結果見表2。

表2 衍生物反應時間比較試驗

試驗結果表明：衍生化反應的時間對試驗結果有較大影響，隨著衍生化時間的延長，部分衍生物峰面積變化較大并且下降，產生降解，但在2～4 min之間，峰面積變化很小，RSD小于1.5%。故反應過程確定為樣品溶液與衍生化試液2∶1混合后，振蕩30 s，準確控制3 min，立即精密吸取20μL，注入液相色譜儀。

2.5 含量測定方法學考察

2.5.1 系統適應性試驗 精密稱定復方α-酮酸片 （批號：20060702）適量，按含量測定項方法制備樣品溶液，立即精密吸取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。見圖1。蘇氨酸理論板數為4 402，峰形較好，每個色譜峰的分離度均大于1.5，說明系統適應性良好。

2.5.2 輔料的影響試驗 取輔料適量，按供試品溶液制備項下的方法制備空白溶液，同法衍生后按上述條件進樣，記錄色譜圖。見圖2。結果表明：空白輔料對各氨基酸（除色氨酸）含量測定無干擾。

2.5.3 標準曲線繪制 精密稱取各種氨基酸對照品，以水配成合適濃度的貯備液，精密量取適量，以水稀釋成系列濃度，按上述方法衍生后HPLC進樣，以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，作線性回歸。結果組氨酸工作曲線為Y=58 383X+14 109，r=0.999 2，表明組氨酸在 12.62～126.20 μg/mL的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系；蘇氨酸工作曲線為Y=90 597X-20 981，r=0.999 8，表明蘇氨酸在18.65～186.50μg/mL的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系；酪氨酸工作曲線為Y=43 058X+19 757，r=0.999 2，表明酪氨酸在12.27～122.70μg/mL的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系；賴氨酸醋酸鹽標準工作曲線為Y=20 174X-13 989，r=0.999 6，表明賴氨酸醋酸鹽在34.23～342.30μg/mL的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.4 回收率試驗 在按處方比例配制的空白輔料中分別加入處方量的80%、100%、120%的各氨基酸對照品，制成模擬樣品各100片的量，精密稱取不同水平模擬樣品各3份，照含量測定方法測定，并計算回收率，結果表明：該方法準確度良好，見表 3～6。

表3 組氨酸含量測定回收率結果

表4 蘇氨酸含量測定回收率結果

表5 酪氨酸含量測定回收率結果

表6 賴氨酸醋酸鹽含量測定回收率結果

2.5.5 重復性試驗 精密量取本品（批號：20060702）適量，共6份，照含量測定項下方法測定其含量。結果表明：重復性良好。見表7。

2.5.6 樣品溶液的穩定性試驗 取本品 （批號：20060702）適量，用水溶解稀釋至每毫升含賴氨酸醋酸鹽105μg/mL的溶液，分別于 0、2、4、6、8 h 時，精密量取供試品溶液 400 μL 與衍生化試液200μL反應，振蕩30 s，準確控制3 min，立即精密吸取20μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。見表8。

表7 復方α-酮酸含量測定重復性試驗

表8 溶液穩定性試驗

結果表明：本品以水作溶媒，在8 h內測定，其峰面積無顯著變化，穩定性較好。

2.5.7 中間精密度試驗 取本品 （批號：20060702）A，B兩份，分別用Waters和島津的儀器于二日內測定其含量，比較其中間精密度。結果RSD分別為0.69%、0.73%和1.23%，表明中間精密度良好，提示本品含量測定方法經方法學驗證，專屬性、重復性、精密度、準確度等皆符合要求。

2.6 結果

取本品10片，去除包衣，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量（約相當于的賴氨酸醋酸鹽約10.5 mg），置100 mL量瓶中，加水溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。另取賴氨酸醋酸鹽約35 g，蘇氨酸約18 mg，氨酸約13 mg，酪氨酸約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加水溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取30 mL，加水溶液稀釋至100 mL，搖勻，作為對照品溶液。精密量取供試品溶液和對照品溶液各400μL分別與衍生化試液[精密稱取鄰苯二甲醛（OPA）0.025 g，用甲醇 1 mL 溶解，加 100 μL 2-巰基乙醇，0.4 mol/L硼酸溶液（PH 9.5，用氫氧化鈉溶液調節）定容至10 mL（當天配制）]200μL反應，振蕩30 s，準確控制3 min，立即精密吸取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算各種氨基酸的含量。三批樣品結果見表8。

3 討論

柱前衍生是在一定條件下利用某個特定試劑 （標記試劑）在色譜柱前與化合物樣品進行化學反應，使反應產生的衍生物利于色譜的分離或檢測。其優點是：通常無需考慮衍生反應的動力學因素；衍生化試劑、反應條件和反應時間的選擇不受色譜系統的限制；不需附加儀器設備。

表8 三批樣品氨基酸含量測定（mg）

OPA是較早用于氨基酸分離分析的一種衍生試劑。1971年提出用OPA作為柱前衍生試劑測定氨基酸。它具有衍生步驟簡單、反應速度快、剩余試劑不干擾測定等特點。OPA與一級胺迅速反應，反應所得衍生物經HPLC分離后即可對其進行高靈敏度熒光檢測，也可以進行一般的紫外吸收檢測。

采用柱前衍生高效液相色譜法測定復方α酮酸片中4種氨基酸含量，具有準確、快速，靈敏度高等優點。此方法簡便可行，無需購買昂貴的專用氨基酸分析儀器即可對氨基酸進行分析。

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