基于lncRNA MALAT1/TGF-β通路調控EMT探討白花蛇舌草抑制大腸癌細胞的遷移和侵襲

陳武進 ，黃 偉 ，陳 勇 ，陳旭征 ，4，華杭菊 ，林久茂 ，4*

（1.福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建 福州 350004；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；3.中西醫結合基礎福建省高等學校重點實驗室，福建 福州 350122；4.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建福州350122）

大腸癌是世界范圍內常見的消化道惡性腫瘤［1］，轉移是大腸癌治療失敗并導致死亡的主要因素［2-3］，抑制腫瘤細胞轉移是防治腫瘤的重要策略，其中上皮-間質轉化（EMT）是大腸癌轉移的主要因素和重要機制之一，調控EMT 對大腸癌轉移至關重要［4］。長非編碼RNA肺癌轉移相關轉錄本1（lncRNA MALAT1）在多種腫瘤中表達異常，對腫瘤細胞轉移有重要調控功能［5］。研究發現lncRNA MALAT1可上調TGF-β 的表達，提高EMT，促進癌細胞轉移［6-9］。白花蛇舌草（Hedyotis diffusaWilld.，HDW）因其顯著的抗腫瘤作用是目前國內外抗腫瘤研究的熱點中藥之一，臨床應用研究顯示其無明顯的毒副作用［10-14］。本課題組前期研究表明HDW 可影響多條腫瘤相關信號通路，發揮抑制大腸癌細胞轉移等作用［11，15-17］。但 HDW 對 lncRNA MALAT1 表達影響與其抑制大腸癌轉移之間的關系尚不明確，因此，本實驗從lncRNA MALAT1/TGF-β 通路調控EMT 角度探討HDW 抑制大腸癌細胞遷移和侵襲的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 人結腸癌SW620 細胞株購于南京凱基生物科技有限公司。

1.2 藥物提取 白花蛇舌草全草用85%乙醇回流提取3次并過濾，合并提取液，濃縮至無醇味，提取液在旋轉蒸發儀上蒸發得到浸膏，然后真空干燥得到干燥粉末，即HDW 提取物。

1.3 實驗試劑 RPMI-1640 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液PBS 均購自美國Life Tech?nologies 公司；Transwell 小室、基質膠均購自美國Corning 公司；BCA 蛋白定量檢測試劑盒、SYBRTM Select Master Mix 試劑均購自美國Thermo 公司；逆轉錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；SDSPAGE 配膠試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；超敏化學發光檢測試劑盒（蘇州宇恒生物科技有限公司）；RIPA 裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）；SDS-PAGE 配膠試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；TGF-β 抗體、Smad4 抗體、E-cad?herin 抗體、N-cadherin 抗體、Vimentin 抗體、GAPDH一抗、HRP 二抗均購自美國CST 公司。

1.4 實驗儀器 CO2培養箱、-80℃超低溫冰箱均購自美國Thermo 公司；多功能酶標儀（奧地利Tecan公司）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；全自動細胞計數儀（美國Life 公司）；垂直電泳槽、化學發光成像系統ChemiDocXRS+均購自美國Bio-Rad 公司。

2 實驗方法

2.1 HDW 藥液的制備 稱取200 mg HDW 提取物溶于1 mL PBS，制備成200 mg/mL HDW 藥液，儲存于-20℃冰箱中。

2.2 SW620 細胞培養及干預 SW620 細胞株培養于含有10%FBS、1%雙抗（含100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）的 RPMI-1640 培養基中，于37℃、5%CO2及飽和濕度的細胞培養箱內培養。細胞匯合度達到80%左右時用0.25%胰酶消化、傳代培養。取對數生長期的SW620 細胞分為0 mg/mL組、0.5 mg/mL組、1 mg/mL組、2 mg/mL組。

2.3 倒置顯微鏡觀察SW620 細胞形態 取各組細胞，按2.5×105個/mL細胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預24 h。24 h 后在倒置顯微鏡下觀察細胞數量、形態變化并拍照記錄。

2.4 CCK-8 法檢測細胞活力 取各組細胞，按1×105個/mL 細胞密度接種于96 孔培養板中，每孔100 μL，細胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預 24 h。24 h 后每孔加入含 10 μL 的CCK-8 溶液100 μL，37℃孵育2 h，于全自動酶標儀450 nm 測定各組吸光度值（即OD 值），并按下列公式計算細胞活力：

細胞活力/%＝藥物組OD 值/0 mg/L組OD 值×100%

2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取各組細胞，按2.5×105個/mL細胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細胞貼壁后，匯合度達到80%～90%時，使用小規格移液槍頭對6 孔板進行劃痕，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預24 h，于0、24 h 時分別在倒置顯微鏡下觀察細胞遷移情況并拍照。

2.6 Transwell 實驗檢測細胞遷移、侵襲能力 取各組細胞，按 2.5×105個/mL 細胞密度接種于 6 孔板中，每孔2 mL，細胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預 24 h。24 h 后吸棄各孔溶液，分別進行消化。空白培養基重懸調整消化后的細胞密度為2.5×105個/mL，將200 μL 細胞懸液滴加于不含基質膠上室（遷移實驗）和含基質膠上室（侵襲實驗），下室加入700 μL 完全培養基，放入恒溫箱培育12 h。12 h 后上室固定于4%多聚甲醛20 min，0.1%結晶紫染色15 min，超純水漂洗3次，棉簽擦拭多余液體后，倒置顯微鏡下觀察被結晶紫染色的遷移細胞數和侵襲細胞數，并拍照。

2.7 RT-qPCR 法檢測 SW620 細胞 lncRNA MALAT1相對表達量 取各組細胞，按2.5×105個/mL 細胞密度接種于6 孔板中，每孔2 mL，細胞貼壁后，各組分別加入 0、0.5、1、2 mg/mL HDW 藥液干預 24 h。24 h 后使用Trizol 試劑提取總RNA。逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應，首先依次加入1 μg 總RNA、2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser后，加DEPC水至10 μL，42℃反應2 min 以除去DNA；隨后再加入 4 μL 5×prime Script buffer、1 μL Mix、1 μL Mix、4 μL DEPC 水，37℃反應15 min，85℃反應 5 s，逆轉錄為cDNA。PCR 反應體系：5 μL Mix、2.2 μL DEPC水、2 μL cDNA、0.4 μL 上游引物、0.4 μL 下游引物，95℃預變性30 s，95℃變性10 s，60℃退火35 s，循環40次。通過7500 FastPCR 儀測定lncRNA MALAT1相對表達量。

2.8 Western blot 檢測 TGF-β、Smad4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表達 取各組細胞，按2.5×105個/mL細胞密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細胞貼壁后，各組分別加入0、0.5、1、2 mg/mL HDW藥液干預24 h。24 h 后棄上清，用PBS 清洗，收集細胞后加入蛋白裂解液，用BCA 法進行蛋白定量，取40 μg 上樣量于聚丙烯酰胺凝膠中電泳；后進行轉膜；用5%脫脂奶粉對目的膜進行封閉1 h；然后于含有0.25%Tween-20的TBST中漂洗15 min（5 min/次，共3次），最后孵育目的一抗（GAPDH、TGF-β、Smad4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin；一抗稀釋比例為1∶1 000）4℃搖床過夜。TBST 洗 3次，5 min/次；用相對應HRP 二抗（稀釋比例為1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST 洗 3次，5 min/次。最后用 ECL 試劑顯影成像。

2.9 統計學方法 采用SPSS 23.0 統計軟件進行數據分析。計量資料屬于正態分布的以（）表示，采用t檢驗和單因素方差分析，非正態分布的采用秩和檢驗；計數資料采用χ2檢驗。

3 結果

3.1 各組細胞數量、形態比較 見圖1。圖1 顯示：隨著藥物濃度的增加，細胞數量減少，形態皺縮變圓。

圖1 各組細胞數量、形態比較（×100）

3.2 各組細胞活力比較 見圖2。圖2 顯示：HDW可以降低SW620細胞活力，呈現一定劑量依賴性。

圖2 各組細胞活力比較

3.3 各組遷移能力比較 劃痕實驗結果見圖3。圖3顯示：與 0 mg/mL組比較，0.5 mg/mL組、1 mg/mL組劃痕內細胞數量較少，2 mg/mL組劃痕內幾乎無細胞分布。Transwell 遷移實驗結果見圖4。圖4 顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW 藥物濃度的增加，各組SW620 細胞遷移數逐漸減少。

圖4 各組Transwell 遷移實驗結果比較（×200）

3.4 各組侵襲能力比較 結果見圖5。圖5 顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW 藥物濃度的增加，各組SW620 細胞侵襲數逐漸減少。

圖5 各組Transwell 侵襲實驗結果比較（×200）

3.5 各組lncRNA MALAT1 相對表達量比較 結果見圖6。圖6 顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW藥物濃度的增加，SW620 細胞lncRNA MALAT1 相對表達量逐漸下調（P＜0.05）。

圖6 各組lncRNA MALAT1 相對表達量比較

3.6 各組 TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達比較 見圖7、表1。結果顯示：與0 mg/mL組比較，隨著HDW 藥物濃度的增加，SW620細胞TGF-β、Smad4、Vimentin、N-cadherin 蛋白表達逐漸降低（P＜0.05），E-cadherin 蛋白表達逐漸增高（P＜0.05）。

表1 各組TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達比較（）

表1 各組TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白表達比較（）

注：與0 mg/mL組比較，1）P＜0.05。

N-cadherin 0.57±0.06 0.54±0.041）0.44±0.051）0.35±0.071）組別0 mg/mL組0.5 mg/mL組1 mg/mL組2 mg/mL組TGF-β 0.78±0.07 0.72±0.031）0.62±0.091）0.53±0.051）Smad4 0.70±0.04 0.59±0.091）0.48±0.051）0.31±0.031）Vimentin 0.61±0.03 0.50±0.081）0.43±0.081）0.37±0.051）E-cadherin 0.31±0.07 0.45±0.031）0.48±0.051）0.57±0.061）

圖7 各組TGF-β、Smad4、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 蛋白條帶圖

4 討 論

目前雖然外科綜合治療大腸癌有了長足發展，但是臨床大腸癌轉移急劇增多，對抗腫瘤藥物的研究也逐漸聚焦于抑制腫瘤轉移。本研究通過CCK-8 檢測發現HDW 具有抑制大腸癌SW620 細胞活力作用，同時通過劃痕和Transwell 實驗，發現隨著HDW 藥物濃度增加，HDW 抑制大腸癌SW620 細胞遷移、侵襲作用也逐漸增強。

研究顯示腫瘤轉移是個復雜過程，腫瘤細胞從原發灶增殖生長到遠處轉移灶要經過漫長行程和諸多生物學應變階段［18］。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤轉移中的作用被逐漸重視，被認為是可能的腫瘤轉移標志物，并將應用于臨床以預測腫瘤轉移及預后。lncRNA MALAT1已經被證實與包括大腸癌在內的多種腫瘤細胞的轉移密切相關，其可上調TGF-β 的表達。活化的TGF-β 進一步與下游轉錄因子Smad4 結合形成復合物轉入細胞核內，并與其他轉錄因子或者輔助蛋白一起調控靶基因轉錄，使E-cadherin 表達下降，N-cadherin、Vimentin 表達增高，提高 EMT 能力，進而使腫瘤細胞的的轉移能力增強［4，18-22］，因此，阻斷lncRNA MALAT1/TGF-β 通路調控 EMT 是有效的防治腫瘤轉移的方式。本研究通過RT-qPCR 法檢測發現HDW 可明顯抑制lncRNA MALAT1 相對表達量，并通過Western blot 檢測發現HDW 可抑制TGF-β、Smad4、Vimentin、N-cadherin 蛋白表達，促進E-cadherin 蛋白表達，且都呈劑量依賴模式。結果表明 HDW 可通過 lncRNA MALAT1/TGF-β 通路調控腫瘤細胞EMT，抑制大腸癌細胞遷移和侵襲，進而抑制大腸癌細胞轉移。

本研究從lncRNA MALAT1/TGFβ 通路調控EMT 角度探討HDW 對大腸癌SW620 細胞遷移和侵襲的抑制作用，為其臨床治療結直腸癌轉移提供科學依據。但由于人體腫瘤轉移過程受到眾多機制的復雜調控，白花蛇舌草對人結腸癌細胞的轉移是否涉及其他信號通路，有待進一步研究探討。