河南周口番茄黃化曲葉病病原分子鑒定

胡京昂 ，劉雪霞 ，蔡雨惠 ，曹剛強 ，應芳卿

番茄黃化曲葉病 （Tomato yellow leaf curl disease，TYLCD）是威脅番茄生產的一種嚴重病害，發病的植株葉片邊緣呈鮮黃色、卷曲，葉脈褪綠，葉肉變厚，葉片變小，嚴重時植株矮化萎縮，一旦發生，番茄產量會受到很大的損失，嚴重時造成絕產。近幾年該病在中國自南向北迅速傳播蔓延，廣東、江蘇、安徽、山東、河北、河南、浙江、上海、北京、臺灣等地均已有報道[1~9]。在國內大部分省市該病是由雙生病毒科 （Geminiviridae）菜豆金色花葉病毒屬（Begamovirus） 番茄黃化曲葉病毒 （Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）侵染引起。

TYLCV寄主主要是番茄、曼陀羅、辣椒、菜豆和煙草等，傳毒介體為煙粉虱，同時可經嫁接傳播，但不能經機械摩擦和種子傳毒[10]。番茄黃化曲葉病毒病已經成為為害世界許多地區番茄生產的毀滅性病害，已給熱帶和亞熱帶地區很多國家的番茄生產造成嚴重損失。

2007年在黃河以南的扶溝縣夏秋茬番茄和開封縣、中牟縣越冬溫室番茄地里均發現典型黃化曲葉癥狀，且煙粉虱發生嚴重；2008年在黃河以北的內黃縣也發生類似的癥狀；自2009年以來，除新野縣以外，河南各番茄產區均有發生，主產區發生尤為嚴重。為了明確引起河南省番茄黃化癥狀的病毒種類及其起源變異，2011年秋季我們在病區采集病樣，并對其部分基因組進行了克隆和分析，結果表明，引起河南省番茄黃化曲葉癥狀的病原為番茄黃化曲葉病毒，這是該病毒病在河南地區發生的首次分子檢測報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病樣采集：2011年秋季在周口地區采集具有黃化曲葉病毒病典型癥狀，植株矮化、葉片卷曲、葉色褪綠、葉片增厚、具黃化癥狀的番茄葉片，-80℃保存備用，編號為HN-ZK。

菌株與載體：大腸桿菌DH5a、pMD18-T載體均購自寶生物（大連）有限公司。

1.2 葉片總DNA提取

利用CTAB法提取番茄葉片總DNA，取0.1 g番茄葉片樣品，液氮中充分研磨，轉入1.5 mL離心管，加入600μL 65℃ 預熱的3%CTAB抽提緩沖液 （3%CTAB，200 mmol/L Tris-HCl，140 mmol/L NaCl，40 mmol/L EDTA，0.2%巰基乙醇)， 混勻后于65℃ 溫育 30 min，再用 600 μL 氯仿/異戊醇（24∶1）抽提兩次后，上清液中加入等體積的異丙醇，經異丙醇沉淀后，取沉淀經70%乙醇洗滌，干燥后溶于TE中，于-20℃保存備用。

1.3 PCR擴增、克隆和序列分析

根據雙生病毒共同區及外殼蛋白基因保守序列設計簡并引物 PA/PB[11]。 PA：5′-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3′，PB：5′-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3′（K=G 或 T；W=A 或 T；V=A，C 或G；S=C 或 G；Y=C 或 T；R=A 或 G；B=C，T 或 G），擴增雙生病毒基因間隔區和部分外殼蛋白基因約500 bp的特異片段，并進行克隆和序列測定，上述引物由北京賽百盛生物技術有限公司合成。

PCR反應體系：10×PCR反應緩沖液 2.5μL，dNTPs 1.0 μL （2.5 mmol/L），PA/PB 引物各 1.0 μL（100 ng/μL），Taq 酶 0.2 μL （5 U/μL）， 模板 DNA 1.0μL，加ddH2O至總體積25μL。PCR反應條件：94℃預變性3 min，按下列條件進行 30個循環（94℃變性 45 s，50℃復性 45 s，72℃延伸 1 min），72℃延伸10 min。取5μL PCR產物，加入loading buffer和Gene Finder后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，在可見光透視儀上顯示電泳結果。經杭州博日科技有限公司的膠回收試劑盒純化約500 bp PCR產物，把純化后的PCR產物克隆到pMD18-T載體（TaKaRa），陽性克隆經驗證后送北京三博遠志生物技術有限公司測序。

1.4 序列分析

獲得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0進行處理和分析，根據相似性明確病毒種類，進化樹構建采用Mega 4.0的臨近相鄰法 （Neighbor-joining）。序列比對和進化分析中所用病毒（分離物）有：番茄黃化曲葉病毒廊坊分離物 （TYLCV-Langfang；JF833036），番茄黃化曲葉病毒浙江分離物 （TYLCV-ZJHZ12；FN256256），中國番茄黃化曲葉病毒四川分離物（TYLCV-SC65A-3；GU199588），中國番茄黃化曲葉病毒廣西分離物 （TYLCV-CHI；AF311734），廣東番茄黃化曲葉病毒廣東分離物（TYLCGDV-G3；AY602166），番茄黃化曲葉病毒安徽分離物（TYLCV-AH-HB1；FN650807），番茄黃化曲葉病毒江蘇分離物 （TYLCV-JSNJ1；FN256259），番茄黃化曲葉病毒北京分離物 （TYLCV-Beijing3；GU983859），番茄黃化曲葉病毒上海分離物（TYLCV-sh10；EU031444）。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果

以提取的番茄葉片DNA為模板，用通用引物PA/PB進行PCR檢測，從HN-ZK樣品中擴增出約500 bp的特異性條帶（圖1），結果表明，河南周口種植的番茄被煙粉虱傳播的雙生病毒侵染。

2.2 序列分析

圖1 PCR檢測結果M：DL1000 DNA Marker；1：HN-ZK 樣品

圖2 雙生病毒基因組DNA-A部分片段核苷酸序列系統進化樹

將PCR得到的500 bp左右的條帶回收并克隆測序，序列全長為539 bp，序列的GenBank登錄號為JQ754307。獲得的DNA序列用DNAMAN Version 4.0進行處理和分析，該序列與番茄黃化曲葉病毒分離物AH-HB1的序列相似性高達98.7%，與其他番茄黃化曲葉病毒分離物序列相似性均在97%以上，而與中國番茄黃化曲葉病毒和廣東番茄黃化曲葉病毒分離物序列相似性均在75%以下，這表明樣品HN-ZK已被番茄黃化曲葉病毒感染而導致番茄黃化曲葉病的發生。將樣品雙生病毒基因組DNA-A部分片段與其他9個具有代表性的雙生病毒分離物核苷酸序列構建系統關系樹（圖2），結果顯示，廣東番茄黃化曲葉病毒、中國番茄黃化曲葉病毒和番茄黃化曲葉病毒分別在3個不同的分支，其中河南分離物與來源于安徽、上海、浙江、江蘇、河北廊坊和北京的番茄黃化曲葉病毒分離物單獨聚為一個小分支，河南分離物與安徽分離物親緣關系相對較近。

3 結論與討論

近幾年，番茄黃化曲葉病在河南省各地相繼暴發，特別是秋延后番茄，給我省的番茄生產造成了巨大的損害。本研究利用分子生物學技術，檢測了河南周口番茄黃化曲葉病的病原，通過PCR、克隆測序發現，侵染周口番茄的雙生病毒為番茄黃化曲葉病毒。鑒于該病在我國的傳播基本呈現自南向北、自東向西的蔓延趨勢，以及序列對比表明，河南分離物與安徽分離物序列相似性最高達到98.7%，從構建的系統進化樹也可以看出，河南分離物與安徽分離物的親緣關系最近，推測河南番茄黃化曲葉病毒可能來源于安徽。

雙生病毒種類繁多，在上海、浙江、江蘇、安徽和北京等省市多為番茄黃化曲葉病毒侵染引起，河南的番茄黃化曲葉病已經初步鑒定為番茄黃化曲葉病毒侵染，但本研究僅克隆測序了一個地區的病害樣本，下一步將在河南各地采集病害樣本，進行全面的檢測和鑒定，徹底明確河南省內為害番茄的雙生病毒種類和分布。

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