西藏林芝地區(qū)間日瘧原蟲PvMSP-3α基因多態(tài)性研究＊

李軍偉，周水森，黃 芳

瘧疾是世界上危害最嚴(yán)重的蟲媒傳播寄生蟲病之一，主要集中于熱帶、亞熱帶和溫帶邊遠(yuǎn)地區(qū)，全球約有40%的人處于瘧疾的威脅之下。據(jù)WHO報告，2009年全球有2.25億瘧疾病例，死亡約78.1萬人［1］。在引起瘧疾的四種瘧原蟲中，間日瘧原蟲是最普遍世界分布最廣的。西藏林芝地區(qū)是西藏自治區(qū)唯一有瘧疾發(fā)生與流行的地區(qū)［2］，其所轄的墨脫縣和察隅縣歷來是瘧疾流行區(qū)，自1986－2008年累計報告瘧疾病例2 296例，由于該地區(qū)人口少，發(fā)病率居全國第一，而且近年來呈逐步增多及向周邊蔓延的趨勢。根據(jù)往年的血檢調(diào)查，表明該地區(qū)以間日瘧傳播為主。

間日瘧原蟲裂殖子表面蛋白3（Plasmodium vivaxmerozoite surface protein-3，PvMSP-3）是存在于間日瘧原蟲裂殖子的重要表面抗原，包括3個不同的種內(nèi)特異基因：PvMSP-3α、PvMSP-3β和PvMSP-3γ。PvMSP-3α分子量約148～150kD，富含丙氨酸，能誘導(dǎo)產(chǎn)生一種抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫力［3］。PvMSP-3α既是瘧疾疫苗開發(fā)的重要候選抗原之一，同時也是瘧疾分子流行病學(xué)重要的分子標(biāo)志。目前，國內(nèi)外研究都證實(shí)PvMSP-3α有不同的基因型，存在廣泛的多態(tài)性［4－5］。以往大量研究證明：不同地理株的間日瘧對媒介按蚊的感染力和對宿主的免疫原性等均有不同，同時它們對抗瘧藥物的治療反應(yīng)亦有明顯的差異［6］。目前，我國已經(jīng)進(jìn)入了瘧疾消除階段，對西藏林芝地區(qū)間日瘧原蟲進(jìn)行相關(guān)分子標(biāo)志研究很有必要。本文利用PCRRFLP技術(shù)，以PvMSP-3α為分子標(biāo)志，對采自西藏林芝的間日瘧原蟲進(jìn)行群體遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，了解當(dāng)?shù)亻g日瘧的遺傳多態(tài)性，為當(dāng)?shù)刂贫ㄓ行У寞懠蚕胧┨峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 間日瘧原蟲采自西藏林芝地區(qū)有瘧疾癥狀，且顯微鏡檢查瘧原蟲為陽性的患者，征得患者同意后采集濾紙血或血涂片，共得到35份樣品。

1.2 瘧原蟲基因組DNA的提取 采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit（250）試劑盒按照說明書步驟對濾紙血或血片進(jìn)行處理。

1.3 間日瘧原蟲PvMSP-3α基因擴(kuò)增 PvMSP-3α基因擴(kuò)增參照文獻(xiàn)［7］，以巢式PCR方法進(jìn)行，第一輪PCR 反應(yīng)體系為 20Ul，引物為，Pl：5′-CAG CAG ACA CCA TTT AAG G-3′，P2：5′-CCG TTT GTT GAT TAG TTG C-3′，以1Ul第一輪PCR產(chǎn)物為第二輪PCR反應(yīng)的模板，第二輪反應(yīng)的體系為20Ul，引物為，Nl：5′-GAC CAG TGT GAT ACC ATT AAC C-3′，N2：5′-ATA CTG GTT CTT CGT CTT CAG G-3′。反應(yīng)條件如下，第一輪PCR：94℃預(yù)變性2min，94℃30s，56 ℃ 30s，68℃2.5min，共30個循環(huán)，72℃延伸10min；第二輪PCR：94℃預(yù)變性2min，94℃30s，56℃30s，68℃2.5min，共30個循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物于l%瓊脂糖凝膠（含5μg/mL溴化乙錠）中2v/cm電泳約60min，紫外燈下觀察，凝膠成像儀中拍照記錄結(jié)果。

1.4 PCR產(chǎn)物酶切分析 取5UlPCR產(chǎn)物，分別用限制性內(nèi)切酶AluI和HhaI在20Ul反應(yīng)體系中（5U酶/反應(yīng)），37℃水浴4h，2.0%瓊脂糖凝膠（5μg/mL溴化乙錠）電泳后，紫外燈下觀察，凝膠成像儀中拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 PvMSP-3α分型結(jié)果 對 PvMSP-3α進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生1 900bp和1 500bp兩種不同目的條帶，依據(jù)目的條帶的長度不同將其分為A型（1.9kb）和B型（1.5kb）（圖1）。35份瘧疾患者血樣成功擴(kuò)出PvMSP-3α基因的為31份（88.6%），未發(fā)現(xiàn)混合條帶，其中A型占90.3%（28/31），B型占9.7%（3/31）。

2.2 PvMSP-3α的 RFLP 結(jié)果 PvMSP-3α的目的條帶用HhaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，A型和B型酶切后在1 000bp處均出現(xiàn)了清晰的條帶（圖2A）。A型酶切后出現(xiàn)6種不同的亞型，其中最常見的是在1 000bp、400bp和200bp處出現(xiàn)條帶。B型酶切后產(chǎn)生1種亞型。如果酶切片段總和大于酶切前片段則可以認(rèn)為是混合感染［8］。將本實(shí)驗(yàn)酶切后的結(jié)果與酶切前比較發(fā)現(xiàn)沒有混合感染。PvMSP-3α的目的條帶用AluⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，A型和B型酶切后在500bp處均出現(xiàn)了清晰的條帶（圖2B）。A型酶切后出現(xiàn)4種不同的亞型，其中最常見的是在500bp、200bp和150bp處出現(xiàn)條帶。B型酶切后產(chǎn)生1種亞型。PvMSP-3α的目的條帶用HhaⅠ和AluⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切結(jié)果各基因型頻率分布見表1。

圖1 PvMSP-3α擴(kuò)增結(jié)果1-28：為 A型，29-31：為B型，M 為 DNA標(biāo)志物Fig.1 Amplification of PvMSP-3α1-28：Type A；29-31：Type B；M：DNA marker

圖2 PvMSP-3α擴(kuò)增片段內(nèi)切酶圖譜A：樣本HhaI內(nèi)切酶產(chǎn)物圖譜，B：樣本AluI內(nèi)切酶產(chǎn)物圖譜，M為DNA標(biāo)志物。Fig.2 PCR-restriction fragment length polymorphism for the amplified products of PvMSP-3αgeneA：Amplified product of PvMSP-3αgene digested by HhaI，M：DNA marker；B：Amplified product of PvMSP-3αgene digested by AluI，M：DNA marker

表1 西藏林芝地區(qū)間日瘧原蟲PvMSP-3α基因擴(kuò)增片段內(nèi)切酶等位基因頻率分布表Tab.1 Frequency of PvMSP-3αalleles of samples in Linzhi Prefecture of Tibet

3 討 論

了解間日瘧原蟲的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)對于預(yù)測新變異的產(chǎn)生和其在群體內(nèi)和群體之間傳播以及對于評估瘧疾消除措施是非常有價值的。

PvMSP-3α是紅內(nèi)期裂殖子侵入紅細(xì)胞的一個表面蛋白，與抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)，被認(rèn)為是間日瘧原蟲疫苗開發(fā)的重要候選抗原之一。PvMSP-3α作為間日瘧原蟲裂殖子的重要表面抗原，不僅在疫苗開發(fā)中被重點(diǎn)研究，對PvMSP-3α、PvMSP-3β和PvMSP-3γ片段的擴(kuò)增也可檢測混合感染。若單一樣本的PCR產(chǎn)物存在多于一種條帶，或單一樣本的PCR產(chǎn)物酶切產(chǎn)物各片段大小總和超過未酶切的PCR產(chǎn)物片段，則可認(rèn)為該樣本為混合感染。同時，該方法也可對樣本遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，間日瘧原蟲蟲株抗原相關(guān)基因存在高度多態(tài)性，提示其宿主免疫逃避功能不斷進(jìn)化。且多個研究證明，即使是在瘧疾的低傳播地區(qū)，如斯里蘭卡、巴西等地，間日瘧原蟲也存在群體遺傳多態(tài)性較高，且有相當(dāng)比例的混合感染［9－10］。瘧原蟲種間及種內(nèi)特定序列的比較及其遺傳變異方式的研究既有利于瘧原蟲蟲種起源的研究，也為尋找有效疫苗提供了有力工具。

目前研究間日瘧原蟲多態(tài)性通常采用測序進(jìn)行序列比對，這可以給我們更為精確的結(jié)果，但在進(jìn)行大規(guī)模的現(xiàn)場調(diào)查需要耗費(fèi)大量的財力和物力，相比較而言PCR-RFLP方法較簡便、快速，給我們進(jìn)行現(xiàn)場研究帶來方便。

本研究結(jié)果表明，西藏林芝地區(qū)間日瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)PvMSP-3α基因A型所占比例為絕對優(yōu)勢，超過90%，未發(fā)現(xiàn)混合感染病例。與其他地區(qū)相比，西藏林芝地區(qū)間日瘧原蟲遺傳多態(tài)性較低。可能與當(dāng)?shù)靥厥獾牡乩砦恢糜嘘P(guān)和氣候環(huán)境有關(guān)。

［1］WHO Global Malaria Programme.World Malaria Report 2010［R］.Geneva：WHO，2010：10-11.

［2］Hu YH，Hu SL，Li CC.Analysis of malaria epidemic in Linzhi District，Tibet Autonomous Region，1986－2004［J］.Chin J Schisto Control，2006，18（2）：124.（in Chinese）胡永紅，胡松林，李成才.1986－2004年西藏林芝地區(qū)瘧疾疫情分析［J］.中國血吸蟲病防治雜志，2006，18（2）：124.

［3］Zakeri S，Barjesteh H，Djadid ND.Merozoite surface protein-3α is a reliable marker for population genetic analysis ofPlasmodium vivax［J］.Malar J，2006，5：53.DOI：10.1186/1475-2875-5-53.

［4］Cui L，Mascorro CN，F(xiàn)an Q，et al.Genetic diversity and multiple infections ofPlasmodium vivaxmalaria in Western Thailand［J］.Am J Trop Med Hyg，2003，68（5）：613-619.

［5］Xiao FZ，Zhang SY，Xu LS，et al.Allelic polymorphism in the merozoite surface protein-3αofPlasmodium vivax［J］.Chin J Zoonoses，2006，22（9）：813-816.（in Chinese）肖方震，張山鷹，許龍善.間日瘧原蟲裂殖子表面蛋白3a基因多態(tài)性研究［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2006，22（9）：813-816.

［6］Huang TY，Mann VH，Cheng Q，et al.Characteristics of polymorphism of circumsporozoite protein gene ofPlasmodium vivaxof different geographical strains［J］.Chin J Parasitol Parasit Dis，1996，14（1）：20-25.（in Chinese）黃天誼，Mann VH，程勤，等.不同地理株間日瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白基因多態(tài)性的特征［J］.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1996，14（1）：20-25.

［7］Bruce MC，Galinski MR，Barnwell JW，et al.Polymorphism at the merozoite surface protein-3alpha locus ofPlasmodium vivax：global and local diversity［J］.Am J Trop Med Hyg，1999，61（4）：518-525.

［8］Bruce MC，Galinski MR，Barnwell JW，et al.Genetic diversity and dynamics ofPlasmodium falciparumandP.vivaxpopulations in multiply infected children with asymptomatic malaria infections in Papua New Guinea［J］.Parasitology，2000，121（Pt 3）：257-272.

［9］Karunaweera ND，F(xiàn)erreira MU，Hartl DL，et al.Fourteen polymorphic microsatellite DNA markers for the human malaria parasitePlasmodium vivax［J］.Mol Ecol Notes，2007，7（1）：172-175.DOI：10.1111/j.1471-8286.2006.01534.x

［10］Ferreira MU，Karunaweera ND，da Silva-Nunes M，et al.Population structure and transmission dynamics ofPlasmodium vivaxin rural Amazonia［J］.J Infect Dis，2007，195（8）：1218-1226.DOI：10.1371/journal.pntd.0001592