淺談檢測腫瘤標(biāo)志物的方法

鄭百波

(長春市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長春 130051)

腫瘤是嚴(yán)重危害人們身體健康的一種疾病，大量臨床研究表明，對于腫瘤患者及早診斷和治療是降低病死率的最有效的方法。大多數(shù)腫瘤患者早期癥狀并不明顯，而且常規(guī)影像診斷、細(xì)胞病理學(xué)診斷、X線檢查等都不能對腫瘤早期做出診斷，因而，這也是導(dǎo)致腫瘤病死率居高不下的主要原因。而目前，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷提高，腫瘤標(biāo)志物的檢測方法在對腫瘤進(jìn)行檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。腫瘤標(biāo)志物（tumor marker，TM）是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的、或者由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的反應(yīng)而生成的，反映腫瘤存在和繁殖的一類物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物從發(fā)現(xiàn)發(fā)展到現(xiàn)在，隨著檢測手段的不斷提高，存在許多檢測方法。現(xiàn)將我院2007年6月至2011年6月共收治的107例腫瘤患者應(yīng)用不同的腫瘤標(biāo)志物檢測方法進(jìn)行檢測的結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2007年6月至2011年6月共收治的107例腫瘤患者，男58例，女49例，年齡在55～78歲之間，平均年齡為66.7歲；其中胃癌患者31例，肺癌患者22例，肝癌患者33例，乳腺癌21例。

1.2 方法

手術(shù)治療或抗腫瘤藥物治療前抽取患者的外周靜脈血3mL用于腫瘤標(biāo)志物檢測。檢測方法主要采用放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法五種方法。

2 結(jié) 果

應(yīng)用四種不同的檢測腫瘤標(biāo)志物的方法，對腫瘤患者進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，時(shí)間分辨熒光免疫分析法對腫瘤患標(biāo)志物的檢測陽性率最高。除了肺癌檢測陽性率為90.91%外，其余均為100%。結(jié)果見表1。

3 討 論

3.1 放射免疫分析法

放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）又稱競爭性飽和分析法，是一種超微量分析技術(shù)，1960年美國化學(xué)家Berson和Yalow在研究胰島素的抗體時(shí)發(fā)現(xiàn)的。主要是利用特異抗體與標(biāo)記抗原的競爭結(jié)合反應(yīng)，通過測定放射性復(fù)合物來計(jì)算出非標(biāo)記抗原量的方法。

3.1.1 原理

已知定量的特異性抗體（Ab）與特異性的標(biāo)記抗原（*Ag），在一定條件下反應(yīng)形成標(biāo)記抗原和抗體的復(fù)合物（*AgAb）。這抗原與抗體復(fù)合物的結(jié)合符合可逆反應(yīng)的規(guī)律。如果在反應(yīng)系統(tǒng)中加入非標(biāo)記的特異性抗原（Ag），則Ag會與標(biāo)記抗原（*Ag）競爭性地與特異性抗體（Ab）結(jié)合，試驗(yàn)結(jié)果表明，反應(yīng)平衡后，經(jīng)分析，標(biāo)記抗原（*Ag）、*Agab或*AgAb與標(biāo)記抗原（*Ag）的比值和非標(biāo)記特異性抗原（Ag）的量呈函數(shù)關(guān)系，由此可以算出AG的含量。

3.1.2 特點(diǎn)

放射免疫分析技術(shù)是用于檢測腫瘤的一種超微量的分析技術(shù)，其主要特點(diǎn)是分離效果好、敏感性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，其標(biāo)記物是抗原。反應(yīng)條件要求不高，但該分析技術(shù)所應(yīng)用試劑具有一定的放射性，如果人體長期接觸，會造成一定的危害。因而，試驗(yàn)人員在進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)做好自身防護(hù)，避免放射性對自身產(chǎn)生損害。同時(shí)，放射免疫分析技術(shù)所應(yīng)用試劑還存在半衰期，因而，試驗(yàn)人員應(yīng)做好試劑規(guī)劃，以免試劑超過半衰期而會作廢。

表1 不同檢測腫瘤標(biāo)志物的方法檢測陽性率比較

3.2 免疫放射分析法

免疫放射分析法（immunoradiometrie assay，IRMA）又稱酶免疫分析法，是由Miles和Hales在1968年提出的檢測腫瘤標(biāo)志物的方法。其與放射免疫分析技術(shù)（RIA）的最大區(qū)別是，免疫放射分析法是非競爭性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，所用標(biāo)記物是抗體。

3.2.1 原理

用過量I125標(biāo)記的抗體與非標(biāo)記抗原反應(yīng)結(jié)合成抗體抗原復(fù)合物，然后用免疫吸附劑除去沒有反應(yīng)的抗體，抗體抗原復(fù)合物的放射性與所加非標(biāo)記抗原的量呈正比關(guān)系。

3.2.2 特點(diǎn)

免疫放射分析法是屬于非競爭性抗體抗原結(jié)合的反應(yīng)；抗體抗原復(fù)合物的量與所加非標(biāo)記抗原的量呈正比關(guān)系；免疫放射分析法的非特異抗體抗原結(jié)合對低劑量區(qū)影響較大，反應(yīng)條件要求也比放射免疫分析法嚴(yán)禁很多。但其靈敏度較放射免疫分析法有所提高，雖然免疫放射分析法比放射免疫分析法靈敏度有了很大的提高，但該技術(shù)僅限于肽類和蛋白質(zhì)，應(yīng)用范圍較小，很多小分子的半抗原不能應(yīng)用此方法進(jìn)行檢測。而且，在進(jìn)行本試驗(yàn)時(shí)，要特別注意待測抗原的濃度，如果測抗原的濃度過高，在試驗(yàn)過程中很容易出現(xiàn)”倒鉤現(xiàn)象”，即待測抗原的濃度高，反而生成的復(fù)合物會有所下降。

3.3 酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)

酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)（enzyme immunoassay，EIA）是用酶分子來代替非特異性標(biāo)記的抗原或抗體的分子的競爭性或非競爭性免疫分析的技術(shù)，近年來，酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于臨床診斷腫瘤中。

3.3.1 原理

酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)的原理與放射免疫分析法基本相同，但酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)是在抗體分子上結(jié)合酶分子，進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，并將反應(yīng)結(jié)合的復(fù)合物與未反應(yīng)原的抗體分離開，取其反應(yīng)的結(jié)合部分，利用酶的催化活性，將結(jié)合復(fù)合物上的標(biāo)記酶將特定的底物轉(zhuǎn)化為特殊的顏色，并應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行含量測定，酶的量與顏色的深淺呈正比關(guān)系，而酶的量又與結(jié)合的復(fù)合物的量呈正比，由此可以計(jì)算出結(jié)合的復(fù)合物的量。

3.3.2 特點(diǎn)

此法既可用于測定蛋白類抗原，亦能用于測定可作為半抗原的類固醇激素等。

酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是對分光光度計(jì)的精確度要求不高，儀器的靈敏度較放免儀的靈敏度有所下降，但酶分子可以產(chǎn)生大量有色產(chǎn)物。會對對儀器的靈敏度給予補(bǔ)償。因此，酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)法也同樣具有較高的靈敏性。且本法不會產(chǎn)生危害。酶的標(biāo)記物低溫保存可穩(wěn)定數(shù)月甚至幾年。測定方法簡便，酶免疫均相分析法尤為快速，且不需特殊設(shè)備，而靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性等堪與放射免疫分析法相比。

但本法易出現(xiàn)“倒鉤”現(xiàn)象，使試驗(yàn)產(chǎn)生假陰性或抗原、抗體的含量比實(shí)際含量下降。另外，酶標(biāo)記免疫分析技術(shù)試驗(yàn)都是一次性的，需要試驗(yàn)人員在特定時(shí)間內(nèi)對顯色反應(yīng)進(jìn)行讀數(shù)。且不可以重復(fù)測量。

3.4 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

3.4.1 化學(xué)免疫發(fā)光分析

化學(xué)免疫發(fā)光分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA） 是一種非放射性標(biāo)記免疫的分析技術(shù)，是應(yīng)用可以產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光性質(zhì)的化合物代替放射性標(biāo)記物質(zhì)，從而根據(jù)發(fā)光信號的強(qiáng)弱來反應(yīng)結(jié)合復(fù)合物含量的方法。

3.4.1.1 原理

化學(xué)免疫發(fā)光分析是以發(fā)光物質(zhì)代替放射性核素或酶成為標(biāo)記物，在反應(yīng)條件下，發(fā)光物質(zhì)在堿性介質(zhì)中氧化時(shí)能夠釋放出大量自由能，生成激發(fā)態(tài)的中間體，該激發(fā)態(tài)的中間體由最低振動(dòng)能級回到穩(wěn)定的基態(tài)，各個(gè)振動(dòng)能級時(shí)產(chǎn)生輻射，同時(shí)產(chǎn)生能量，多余的能量即為發(fā)光因子，從而產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。并應(yīng)用發(fā)光信號的測量儀器對發(fā)出的光子量進(jìn)行測定，分析光量子的產(chǎn)量，并通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成復(fù)合物的濃度單位。

3.4.1.2 特點(diǎn)

化學(xué)免疫發(fā)光分析的優(yōu)點(diǎn)主要是簡便易行，并具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性，沒有應(yīng)用放射性元素，對人體不會造成危害，且便于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化和不對環(huán)境產(chǎn)生污染。但其發(fā)光時(shí)間較短，因而，試驗(yàn)人員要嚴(yán)格掌握檢測時(shí)間，以避免對試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。但試驗(yàn)產(chǎn)生的發(fā)光分子只能使用一次，不可重復(fù)利用。

3.4.2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是應(yīng)用堿性磷酸酶來標(biāo)記抗體的分析技術(shù)，底物應(yīng)用的是環(huán)1，2—二氧乙烷衍生物。通過夾心法免疫反應(yīng)，使結(jié)合成的復(fù)合物帶有酶標(biāo)記，酶能夠促使反應(yīng)底物斷裂，而產(chǎn)生發(fā)光量子。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)由于酶的存在，發(fā)光時(shí)間較化學(xué)免疫法的發(fā)光時(shí)間長，但其結(jié)果更準(zhǔn)確。但試驗(yàn)所產(chǎn)生的發(fā)光量子只能應(yīng)用一次，不可重復(fù)應(yīng)用。

3.4.3 電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是化學(xué)發(fā)光免疫分析中的新型的免疫標(biāo)記的分析技術(shù)。是用三丙胺做為標(biāo)記物，反應(yīng)形成的復(fù)合物中含有三丙胺，三丙胺在電極周圍會失去電子而成為還原劑。底物應(yīng)用的是三價(jià)釘?shù)幕衔铮摶衔镌谶€原劑三丙胺的作用下還原成二價(jià)釘，同時(shí)發(fā)出光量子。發(fā)射光量子后的二價(jià)釘即還原成三價(jià)，又可再次被還原，再發(fā)射光量子，從而顯著提高信號的強(qiáng)度。較化學(xué)免疫發(fā)光分析技術(shù)和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)的結(jié)果更穩(wěn)定可靠，信號明顯增強(qiáng)發(fā)射的光子能反復(fù)利用等特點(diǎn)。

3.5 時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（time—resolved fluoroim—munoassay，TrFLA）是20世紀(jì)80年代初Pettersson和Eskola等創(chuàng)立的一種免疫非放射性標(biāo)記的分析技術(shù)，其標(biāo)記物由鑭系元素（如銪（Eu）、鋱（Tb）、鈮（Nd）等）通過一定的連接劑與抗體蛋白相連而組成。

3.5.1 原理

時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)的原理是應(yīng)用三價(jià)稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等，以標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針。通過免疫反應(yīng)后，待測物形成的復(fù)合物上帶有鑭系元素，通常情況下應(yīng)用的是銪元素。通過紫外線激發(fā)銪元素使其發(fā)出較長波長的熒光。在結(jié)合反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入一個(gè)”熒光增強(qiáng)劑”，以增強(qiáng)熒光強(qiáng)度。且上述激發(fā)可以反復(fù)多次激發(fā)，因而，可大大提高信號的強(qiáng)度。直到熒光衰減到很低水平時(shí)反應(yīng)才結(jié)束，此時(shí)停止記錄。熒光強(qiáng)度與待測物的濃度相關(guān)，通過計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)測定出待測物的濃度。

3.5.2 特點(diǎn)

具有信號強(qiáng)，激發(fā)光譜帶較寬，可提高標(biāo)記物的比活性，同時(shí)發(fā)射光譜較窄，可提高分辨率，并能夠縮短測量時(shí)間，提高靈敏度。但時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)的標(biāo)記物和熒光增強(qiáng)劑制備過程難度大，且熒光增強(qiáng)劑中含一定量的有毒物質(zhì)，如處理不當(dāng)會對人體及環(huán)境產(chǎn)生較大損害，因而，在試驗(yàn)人員在應(yīng)用增強(qiáng)劑時(shí)，要對廢物進(jìn)行嚴(yán)格的處理。

近年來，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的提高以及腫瘤基礎(chǔ)研究的深入，腫瘤標(biāo)志物的檢測得到了醫(yī)務(wù)臨床工作者的廣泛重視[1-9]。同時(shí)，由于臨床檢測技能的不斷提高以及檢測方法的不斷改進(jìn)，腫瘤標(biāo)志物檢測的種類、水平以及它們的靈敏度和特異性也都有了很大的進(jìn)步。檢測的靈敏度、特異性以及準(zhǔn)確性的不斷提高，為腫瘤患者的早期診斷和早期治療提供了更加可靠的理論依據(jù)。本研究通過對我院收治的107例腫瘤患者腫瘤標(biāo)志物的檢測方法的診斷準(zhǔn)確性進(jìn)行了探討，應(yīng)用五種腫瘤標(biāo)志物的檢測方法，放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法對腫瘤患者進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，時(shí)間分辨熒光免疫分析法對腫瘤患標(biāo)志物的檢測陽性率最高。除了肺癌檢測陽性率為90.91%外，其余均為100%。

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