淺談檢測腫瘤標志物的方法

鄭百波

(長春市人民醫院檢驗科，吉林 長春 130051)

腫瘤是嚴重危害人們身體健康的一種疾病，大量臨床研究表明，對于腫瘤患者及早診斷和治療是降低病死率的最有效的方法。大多數腫瘤患者早期癥狀并不明顯，而且常規影像診斷、細胞病理學診斷、X線檢查等都不能對腫瘤早期做出診斷，因而，這也是導致腫瘤病死率居高不下的主要原因。而目前，隨著醫學技術的不斷提高，腫瘤標志物的檢測方法在對腫瘤進行檢測中得到了廣泛的應用。腫瘤標志物（tumor marker，TM）是指在腫瘤發生和增殖過程中，由腫瘤細胞本身所產生的、或者由機體對腫瘤細胞所產生的反應而生成的，反映腫瘤存在和繁殖的一類物質。腫瘤標志物從發現發展到現在，隨著檢測手段的不斷提高，存在許多檢測方法。現將我院2007年6月至2011年6月共收治的107例腫瘤患者應用不同的腫瘤標志物檢測方法進行檢測的結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2007年6月至2011年6月共收治的107例腫瘤患者，男58例，女49例，年齡在55～78歲之間，平均年齡為66.7歲；其中胃癌患者31例，肺癌患者22例，肝癌患者33例，乳腺癌21例。

1.2 方法

手術治療或抗腫瘤藥物治療前抽取患者的外周靜脈血3mL用于腫瘤標志物檢測。檢測方法主要采用放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標記免疫分析法、化學免疫發光分析法、時間分辨熒光免疫分析法五種方法。

2 結 果

應用四種不同的檢測腫瘤標志物的方法，對腫瘤患者進行檢測，結果顯示，時間分辨熒光免疫分析法對腫瘤患標志物的檢測陽性率最高。除了肺癌檢測陽性率為90.91%外，其余均為100%。結果見表1。

3 討 論

3.1 放射免疫分析法

放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）又稱競爭性飽和分析法，是一種超微量分析技術，1960年美國化學家Berson和Yalow在研究胰島素的抗體時發現的。主要是利用特異抗體與標記抗原的競爭結合反應，通過測定放射性復合物來計算出非標記抗原量的方法。

3.1.1 原理

已知定量的特異性抗體（Ab）與特異性的標記抗原（*Ag），在一定條件下反應形成標記抗原和抗體的復合物（*AgAb）。這抗原與抗體復合物的結合符合可逆反應的規律。如果在反應系統中加入非標記的特異性抗原（Ag），則Ag會與標記抗原（*Ag）競爭性地與特異性抗體（Ab）結合，試驗結果表明，反應平衡后，經分析，標記抗原（*Ag）、*Agab或*AgAb與標記抗原（*Ag）的比值和非標記特異性抗原（Ag）的量呈函數關系，由此可以算出AG的含量。

3.1.2 特點

放射免疫分析技術是用于檢測腫瘤的一種超微量的分析技術，其主要特點是分離效果好、敏感性強、準確度高，其標記物是抗原。反應條件要求不高，但該分析技術所應用試劑具有一定的放射性，如果人體長期接觸，會造成一定的危害。因而，試驗人員在進行試驗時，應做好自身防護，避免放射性對自身產生損害。同時，放射免疫分析技術所應用試劑還存在半衰期，因而，試驗人員應做好試劑規劃，以免試劑超過半衰期而會作廢。

表1 不同檢測腫瘤標志物的方法檢測陽性率比較

3.2 免疫放射分析法

免疫放射分析法（immunoradiometrie assay，IRMA）又稱酶免疫分析法，是由Miles和Hales在1968年提出的檢測腫瘤標志物的方法。其與放射免疫分析技術（RIA）的最大區別是，免疫放射分析法是非競爭性抗原抗體結合反應，所用標記物是抗體。

3.2.1 原理

用過量I125標記的抗體與非標記抗原反應結合成抗體抗原復合物，然后用免疫吸附劑除去沒有反應的抗體，抗體抗原復合物的放射性與所加非標記抗原的量呈正比關系。

3.2.2 特點

免疫放射分析法是屬于非競爭性抗體抗原結合的反應；抗體抗原復合物的量與所加非標記抗原的量呈正比關系；免疫放射分析法的非特異抗體抗原結合對低劑量區影響較大，反應條件要求也比放射免疫分析法嚴禁很多。但其靈敏度較放射免疫分析法有所提高，雖然免疫放射分析法比放射免疫分析法靈敏度有了很大的提高，但該技術僅限于肽類和蛋白質，應用范圍較小，很多小分子的半抗原不能應用此方法進行檢測。而且，在進行本試驗時，要特別注意待測抗原的濃度，如果測抗原的濃度過高，在試驗過程中很容易出現”倒鉤現象”，即待測抗原的濃度高，反而生成的復合物會有所下降。

3.3 酶標記免疫分析技術

酶標記免疫分析技術（enzyme immunoassay，EIA）是用酶分子來代替非特異性標記的抗原或抗體的分子的競爭性或非競爭性免疫分析的技術，近年來，酶聯免疫吸附分析技術現在已被廣泛應用于臨床診斷腫瘤中。

3.3.1 原理

酶標記免疫分析技術的原理與放射免疫分析法基本相同，但酶標記免疫分析技術是在抗體分子上結合酶分子，進行結合反應，并將反應結合的復合物與未反應原的抗體分離開，取其反應的結合部分，利用酶的催化活性，將結合復合物上的標記酶將特定的底物轉化為特殊的顏色，并應用紫外分光光度計進行含量測定，酶的量與顏色的深淺呈正比關系，而酶的量又與結合的復合物的量呈正比，由此可以計算出結合的復合物的量。

3.3.2 特點

此法既可用于測定蛋白類抗原，亦能用于測定可作為半抗原的類固醇激素等。

酶標記免疫分析技術的優點是對分光光度計的精確度要求不高，儀器的靈敏度較放免儀的靈敏度有所下降，但酶分子可以產生大量有色產物。會對對儀器的靈敏度給予補償。因此，酶標記免疫分析技術法也同樣具有較高的靈敏性。且本法不會產生危害。酶的標記物低溫保存可穩定數月甚至幾年。測定方法簡便，酶免疫均相分析法尤為快速，且不需特殊設備，而靈敏度、準確性、特異性等堪與放射免疫分析法相比。

但本法易出現“倒鉤”現象，使試驗產生假陰性或抗原、抗體的含量比實際含量下降。另外，酶標記免疫分析技術試驗都是一次性的，需要試驗人員在特定時間內對顯色反應進行讀數。且不可以重復測量。

3.4 化學發光免疫分析技術

3.4.1 化學免疫發光分析

化學免疫發光分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA） 是一種非放射性標記免疫的分析技術，是應用可以產生化學發光性質的化合物代替放射性標記物質，從而根據發光信號的強弱來反應結合復合物含量的方法。

3.4.1.1 原理

化學免疫發光分析是以發光物質代替放射性核素或酶成為標記物，在反應條件下，發光物質在堿性介質中氧化時能夠釋放出大量自由能，生成激發態的中間體，該激發態的中間體由最低振動能級回到穩定的基態，各個振動能級時產生輻射，同時產生能量，多余的能量即為發光因子，從而產生發光現象。并應用發光信號的測量儀器對發出的光子量進行測定，分析光量子的產量，并通過計算機系統轉換成復合物的濃度單位。

3.4.1.2 特點

化學免疫發光分析的優點主要是簡便易行，并具有較高的靈敏度和穩定性，沒有應用放射性元素，對人體不會造成危害，且便于實現全自動化和不對環境產生污染。但其發光時間較短，因而，試驗人員要嚴格掌握檢測時間，以避免對試驗結果產生影響。但試驗產生的發光分子只能使用一次，不可重復利用。

3.4.2 化學發光酶免疫分析技術

化學發光酶免疫分析技術（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是應用堿性磷酸酶來標記抗體的分析技術，底物應用的是環1，2—二氧乙烷衍生物。通過夾心法免疫反應，使結合成的復合物帶有酶標記，酶能夠促使反應底物斷裂，而產生發光量子。化學發光酶免疫分析技術由于酶的存在，發光時間較化學免疫法的發光時間長，但其結果更準確。但試驗所產生的發光量子只能應用一次，不可重復應用。

3.4.3 電化學發光免疫分析技術

電化學發光免疫分析技術（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是化學發光免疫分析中的新型的免疫標記的分析技術。是用三丙胺做為標記物，反應形成的復合物中含有三丙胺，三丙胺在電極周圍會失去電子而成為還原劑。底物應用的是三價釘的化合物，該化合物在還原劑三丙胺的作用下還原成二價釘，同時發出光量子。發射光量子后的二價釘即還原成三價，又可再次被還原，再發射光量子，從而顯著提高信號的強度。較化學免疫發光分析技術和化學發光酶免疫分析技術的結果更穩定可靠，信號明顯增強發射的光子能反復利用等特點。

3.5 時間分辨熒光免疫分析技術

時間分辨熒光免疫分析技術（time—resolved fluoroim—munoassay，TrFLA）是20世紀80年代初Pettersson和Eskola等創立的一種免疫非放射性標記的分析技術，其標記物由鑭系元素（如銪（Eu）、鋱（Tb）、鈮（Nd）等）通過一定的連接劑與抗體蛋白相連而組成。

3.5.1 原理

時間分辨熒光免疫分析技術的原理是應用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質、酶和化學發光物質等，以標記抗原、抗體、核酸探針。通過免疫反應后，待測物形成的復合物上帶有鑭系元素，通常情況下應用的是銪元素。通過紫外線激發銪元素使其發出較長波長的熒光。在結合反應結束后，向反應體系中加入一個”熒光增強劑”，以增強熒光強度。且上述激發可以反復多次激發，因而，可大大提高信號的強度。直到熒光衰減到很低水平時反應才結束，此時停止記錄。熒光強度與待測物的濃度相關，通過計算機數據處理系統測定出待測物的濃度。

3.5.2 特點

具有信號強，激發光譜帶較寬，可提高標記物的比活性，同時發射光譜較窄，可提高分辨率，并能夠縮短測量時間，提高靈敏度。但時間分辨熒光免疫分析技術的標記物和熒光增強劑制備過程難度大，且熒光增強劑中含一定量的有毒物質，如處理不當會對人體及環境產生較大損害，因而，在試驗人員在應用增強劑時，要對廢物進行嚴格的處理。

近年來，隨著醫學技術的提高以及腫瘤基礎研究的深入，腫瘤標志物的檢測得到了醫務臨床工作者的廣泛重視[1-9]。同時，由于臨床檢測技能的不斷提高以及檢測方法的不斷改進，腫瘤標志物檢測的種類、水平以及它們的靈敏度和特異性也都有了很大的進步。檢測的靈敏度、特異性以及準確性的不斷提高，為腫瘤患者的早期診斷和早期治療提供了更加可靠的理論依據。本研究通過對我院收治的107例腫瘤患者腫瘤標志物的檢測方法的診斷準確性進行了探討，應用五種腫瘤標志物的檢測方法，放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標記免疫分析法、化學免疫發光分析法、時間分辨熒光免疫分析法對腫瘤患者進行檢測，結果顯示，時間分辨熒光免疫分析法對腫瘤患標志物的檢測陽性率最高。除了肺癌檢測陽性率為90.91%外，其余均為100%。

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