怡腎丸Ⅰ號(hào)對(duì)UUO大鼠行為性狀及腎組織形態(tài)學(xué)的影響※

周 珂 何澤云* 龍華君 左和寧 彭亞軍

（1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，長(zhǎng)沙410007；2 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙410006；）

怡腎丸Ⅰ號(hào)對(duì)UUO大鼠行為性狀及腎組織形態(tài)學(xué)的影響※

周 珂1何澤云1* 龍華君2左和寧1彭亞軍1

（1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，長(zhǎng)沙410007；2 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙410006；）

目的 觀察怡腎丸Ⅰ號(hào)對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠生活狀態(tài)、體重及其腎臟病理的影響。方法 將50只SD大鼠分為怡腎丸Ⅰ號(hào)組、依那普利組、空白組、假手術(shù)組及模型組，連續(xù)灌胃14d后，觀察各組大鼠的生活狀態(tài)、體重及其腎組織的病理改變情況。結(jié)果 怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組生活狀態(tài)、體重和腎組織的病理改變方面都明顯輕于模型組（P＜0.01）。結(jié)論 怡腎丸Ⅰ號(hào)對(duì)UUO大鼠的生活狀態(tài)、體重和腎組織都有明顯改善。

怡腎丸Ⅰ號(hào)，UUO，大鼠，生活狀態(tài)，腎組織形態(tài)學(xué)

腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能減退的相關(guān)性較腎小球硬化與腎功能減退的相關(guān)性更為密切[1]，大量實(shí)驗(yàn)證明，單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）大鼠是腎間質(zhì)纖維化病變非常成功的動(dòng)物模型。本研究采用此方法造模，觀察自制藥物怡腎丸Ⅰ號(hào)對(duì)UUO大鼠的生活狀態(tài)、體重及腎組織病理形態(tài)學(xué)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只體重為（200±20）g的健康Sprague-Dawlley（SD）雄性大鼠（湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）被分為怡腎丸Ⅰ號(hào)組、依那普利組、空白組，假手術(shù)組和模型組，每組10只，均飼養(yǎng)在通風(fēng)、恒溫、安靜的環(huán)境中。

1.1.2 藥物 怡腎丸Ⅰ號(hào)（批準(zhǔn)文號(hào)：湘Y20101123，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供），組成藥物：白花蛇舌草，熟地黃，生地黃，白術(shù)，砂仁，山茱萸，五味子，蟬蛻等。馬來(lái)酸依那普利片（國(guó)藥準(zhǔn)字：H32026567，揚(yáng)子江制藥股份有限公司提供）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 美誠(chéng)MW-30超純水器、YD-1508R石蠟切片機(jī)、BX51T-72P01型OLYMP光學(xué)顯微照相系統(tǒng)、T-214電子分析天平等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 50只體重為（200±20）g的SD雄性大鼠被分為怡腎丸Ⅰ號(hào)組，依那普利組，空白組，假手術(shù)組，模型對(duì)照組，每組10只。假手術(shù)組SD大鼠僅僅將左側(cè)輸尿管分離，而不結(jié)扎和剪斷?？瞻捉M大鼠不開(kāi)腹。其余各組則按klahr S等[2]的方法造模：各組大鼠均以10%水合氯醛麻醉（0.35ml/100g）后分別將各組大鼠逐一俯臥位固定于固定板上，于大鼠左側(cè)背部剪掉大概3 ×2cm范圍的鼠毛，并用絡(luò)合碘消毒后向尾部方向切開(kāi)皮膚約2cm，鋪無(wú)菌紗布，逐層鈍性分離皮下組織及肌層，充分暴露左側(cè)腎臟，沿腎蒂找到左輸尿管，在中上1/3處以雙4號(hào)手術(shù)線結(jié)扎兩處，從結(jié)扎線之間切斷輸尿管，造成左側(cè)輸尿管完全梗阻，再逐層縫合。于第2天開(kāi)始分組灌胃，分別上午8點(diǎn)和下午5點(diǎn)各灌胃1次，其中怡腎丸Ⅰ號(hào)組按（60kg重成人的劑量×0.018×5/Kg體重）計(jì)算，溶于4ml蒸餾水灌胃，依那普利組按10mg/kg?d溶于等體積蒸餾水灌胃，正常組、假手術(shù)組、模型組均予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃14天。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 大鼠行為性狀變化比較 自造模前至處死時(shí)，每天觀察各組大鼠的生活狀態(tài)、體重、對(duì)外界刺激的反應(yīng)。分別于造模前及造模后14天用電子秤稱量各組大鼠體重。1.3.2 大鼠腎臟濕重比較 灌胃14d后，處死所有大鼠，分別用電子天枰稱量各組大鼠左腎臟的濕重。

1.3.3 大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)比較 灌胃14d后，處死所有大鼠，取出左腎，將腎組織行冠狀切面，取約綠豆大小腎組織放入4%多聚甲醛固定，再行常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片后分別進(jìn)行HE及Masson染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。組間差異采用單因素方差分析比較，組內(nèi)差異采用成組t檢驗(yàn)比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量資料以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠生活狀態(tài)的比較 造模前各組大鼠均飲食正常，皮毛光亮、對(duì)噪聲刺激反應(yīng)敏捷。造模后第14天各組大鼠均無(wú)死亡。但是，模型組大鼠明顯食欲下降，皮毛無(wú)光并且脫毛明顯，對(duì)噪聲刺激反應(yīng)遲鈍。而在造模后第14天，從飲食、毛色及對(duì)外界的反應(yīng)情況看，怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組大鼠明顯優(yōu)于模型組大鼠，而空白組和假手術(shù)組在實(shí)驗(yàn)前后直觀上均無(wú)明顯差異且優(yōu)于模型組。

2.2 實(shí)驗(yàn)前后各組大鼠體重變化比較 各組大鼠體重均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加。但空白組、假手術(shù)組和模型組與怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組比較有顯著性差異（P＜0.01），而怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組在灌胃14d后比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠體重變化情況 (g，±s)

表2 造模14d各組大鼠左腎濕體重比較 (g，±s )

由表1可以看出造模14d后。

2.3 各組大鼠左腎濕重比較 各組大鼠左腎濕重對(duì)比：假手術(shù)組、模型組、怡腎丸Ⅰ號(hào)組、依那普利組大鼠與空白組大鼠左腎濕重比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；治療組、假手術(shù)組、怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組與模型組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），但依那普利組和怡腎丸Ⅰ號(hào)組大鼠左腎濕重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠腎組織HE染色及Masson染色病理形態(tài)學(xué)比較 怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組大鼠左腎較空白組和假手術(shù)組大鼠腫脹，顏色變淺，結(jié)扎處以上的輸尿管粗大，冠狀面顏色較淺，腎皮質(zhì)尤甚，而腎盂、腎盞均有所擴(kuò)張，其中有些標(biāo)本還可見(jiàn)混濁尿液，腎乳頭變平，腎實(shí)質(zhì)變薄，皮髓交界處欠清。模型組大鼠左腎普遍又比怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組大鼠左腎大，顏色更暗，腎盂、腎盞內(nèi)可見(jiàn)纖維組織粘連，腎皮質(zhì)萎縮更明顯。而空白組和假手術(shù)組大鼠左腎大小差異不明顯，顏色暗紅，輸尿管無(wú)明顯增粗，腎盂、腎盞未見(jiàn)擴(kuò)張，腎乳頭清晰，皮髓分界也較明顯。HE染色及Masson染色發(fā)現(xiàn)，空白組和假手術(shù)組大鼠的腎間質(zhì)無(wú)異常改變，無(wú)纖維組織增，腎小管、腎小球基本正常；模型組可見(jiàn)腎小管高度擴(kuò)張，小管基底膜較薄，間質(zhì)區(qū)細(xì)胞大量增生，腎間質(zhì)纖維化，腎間質(zhì)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；怡腎丸Ⅰ號(hào)組腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)輕度纖維化，見(jiàn)間質(zhì)區(qū)局灶性細(xì)胞增生，部分腎小管輕度擴(kuò)張，病變程度較模型組輕。（見(jiàn)附圖1-10）

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在腎間質(zhì)內(nèi)過(guò)度沉積，是腎臟結(jié)構(gòu)毀損的必由之路，因而如何阻止或延緩腎間質(zhì)纖維化就成了延緩或阻止腎功能進(jìn)行性惡化的關(guān)鍵。長(zhǎng)期以來(lái)，廣大醫(yī)務(wù)工作者一直致力于研究如何延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，希望籍此達(dá)到延緩腎功能進(jìn)行性惡化的目的。由于臨床研究的受限，人們?cè)谘泳從I間質(zhì)纖維化方面做了大量的實(shí)驗(yàn)研究，其中較為成熟的單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型（UUO）就是人為的造成尿液排出受阻，使腎盂、腎小管內(nèi)壓力升高，腎盂等集合管系統(tǒng)擴(kuò)張，使得腎間質(zhì)水腫，同時(shí)可出現(xiàn)局灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致了腎間質(zhì)纖維化及腎萎縮的發(fā)生?，F(xiàn)已有很多對(duì)UUO大鼠的研究報(bào)道[3-5]，既反映了UUO大鼠在腎間質(zhì)纖維化研究中所起的重要作用，也反映了廣大醫(yī)務(wù)工作者目前仍在尋求對(duì)腎間質(zhì)纖維化安全有效的治療方法。

已有研究發(fā)現(xiàn)[6]，依那普利可減輕梗阻腎間質(zhì)纖維化。而怡腎丸Ⅰ號(hào)是我院何澤云教授經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐和反復(fù)總結(jié)研制而成，在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出降尿蛋白，改善腎功能的作用。本研究以UUO大鼠作為腎間質(zhì)纖維化的觀察對(duì)象，探尋怡腎丸Ⅰ號(hào)的效應(yīng)點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)怡腎丸Ⅰ號(hào)組大鼠的生活狀態(tài)、體重及對(duì)外界刺激反應(yīng)都明顯優(yōu)于模型組，而在實(shí)驗(yàn)完成前后怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組相比較并無(wú)明顯差異。觀察發(fā)現(xiàn)，各組大鼠體重均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，但模型組體重明顯低于怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組。ACEI類藥物對(duì)腎臟的保護(hù)作用已是一不爭(zhēng)事實(shí)，2組在生活狀態(tài)方面的相似表現(xiàn)也就證實(shí)了怡腎丸Ⅰ號(hào)對(duì)腎臟的保護(hù)作用。同時(shí)，各組大鼠腎組織病理切片顯示：怡腎丸Ⅰ號(hào)組和依那普利組腎間質(zhì)纖維化程度明顯低于模型組，這從病理形態(tài)學(xué)方面闡明了怡腎丸Ⅰ號(hào)對(duì)腎間質(zhì)纖維化的改善作用。怡腎丸Ⅰ號(hào)組方中的熟地黃、白花蛇舌草共為君藥，體現(xiàn)了補(bǔ)腎瀉濁之意。白術(shù)、山茱萸、生地黃補(bǔ)脾益腎澀精，同為臣藥。五味子收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心；砂仁行氣止痛、溫胃止嘔；蟬蛻散風(fēng)除熱共為佐藥。這些藥物組合在一起脾腎兼顧，補(bǔ)瀉兼施，具扶正排毒之功，具有臨床使用價(jià)值，也值得進(jìn)一步研究完善。

附圖：HE染色（200倍）：

圖1 空白組：腎小管正常，腎間質(zhì)無(wú)增生

圖2 假手術(shù)組腎小管正常，腎間質(zhì)無(wú)增生

圖3 模型組：腎小管高度擴(kuò)張，小管基底膜較薄,間質(zhì)區(qū)細(xì)胞大量增生，腎間質(zhì)纖維化

圖4 怡腎丸Ⅰ號(hào)組：部分腎小管輕度擴(kuò)張，局灶性間質(zhì)區(qū)細(xì)胞增生

圖5 依那普利組: 部分腎小管擴(kuò)張， 管壁變薄，腎間質(zhì)輕度細(xì)胞增生

Masson染色（400倍）：

圖6 空白組：腎小管、腎小球基本正常，間質(zhì)未見(jiàn)增生

圖7 假手術(shù)組：腎小管、腎小球基本正常，間質(zhì)未見(jiàn)增生

圖8 模型組：腎小管纖維組織增生，小管擴(kuò)張，伴大量間質(zhì)纖維增生

圖9 怡腎丸Ⅰ號(hào)組：局灶性間質(zhì)纖維增生，部分小管纖維化，伴小管擴(kuò)張

圖10 依那普利組：部分小管纖維化，局灶性間質(zhì)纖維化，部 分小管塌陷

[1] 劉娜,嚴(yán)海東.腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化在腎間質(zhì)纖維化中的研究進(jìn)展[J].國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志,2006,26(6):854.

[2] klahr S, MorrisseyJ. Obstructive ephropathy and renal fibrosis [J]. Am J Physiol, 2002,283(5):861-875.

[3] 馬曉鵬,宋立群,于思明,等.蟲(chóng)草腎茶顆粒對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)纖維化模型CTGFmRNA的影響[J].中國(guó)臨床保健,2010,13(3):271-274.

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[5] 孫培榮,石永兵,施曉松.銀杏達(dá)莫對(duì)梗阻性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用[J].現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué),2010,36(3):171-173.

[6] 王琳娜,寧旺斌, 陶立堅(jiān),等.動(dòng)態(tài)觀察依那普利對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠TGF-β1, CTGF, Smad7和α-SMA的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,34(03) 252-258.

Effects of Yishenwan Ⅰon Behavior and Renal Morphology in UUO Rats

Zhou Ke1He Zeyun1Long Huajun2Zuo Hening1Peng Yajun1(1 Department of Nephrology ,First Affiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medical University , Changsha 410007,China; 2 The Affiliated Hospital of Hunan Traditional Chinese Medicine Institute, Changsha 410006, China)

Objective To evaluate the effect of Yishenwan Ⅰon life station, body weight and renal pathological on unilateral ureteral ligation rats. Methods 50 SD rats were divided Yishenwan Ⅰgroup, enalapril group, control group, sham operation group and model group, respectively. After continuously being intragastriced 14 days, the life sttation, body weight and kidney tissue pathological of rats in each group were observated. Results After 14 days, the life station, weight and pathology of Yishenwan Ⅰgroup and enalapril group were significantly different from the other groups rats (P＜0.01). Conclusion It is a significent improvement of Yi shenwan Ⅰon the life station, body weight and renal pathological UUO rats.

YishenwanⅠ; UUO; rats; life station, Renal morphology

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.15.106

1672-2779（2012）-15-0161-03

韓世輝

2012-05-14）

湖南省科技廳資助項(xiàng)目[No：（2009）42]

湖南省自然科學(xué)基金（重點(diǎn)）[No：09JJ3064]

湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)[No：09K059]