高效毛細管電泳法測定黃芪中黃芪甲苷的含量

楊天鳴,裴 婷,付海燕,黃 燦,王云英

(中南民族大學藥學院，湖北 武漢 430074)

0 引 言

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.) 的干燥根；春、秋二季采挖，除去須根及根頭，曬干；具補氣固表，利尿托毒，排濃，斂瘡生肌的作用[1].黃芪甲苷是黃芪的主要有效成分之一，常作為黃芪藥材和含黃芪中成藥的質量指標.文獻報告測定黃芪甲苷含量的方法有很多，如高效液相色譜法[2]，薄層掃描法[3]等，但未見用高效毛細管電泳( HPCE)法對黃芪甲苷進行定量分析的報道.本研究對高效毛細管電泳儀測定黃芪甲苷的含量的分析條件進行了研究，得到較好結果.

1 實驗部分

1.1 儀器

P/ACE MDQ型毛細管電泳儀(美國Beckman 公司，二極管陣列檢測器); 彈性未涂層石英毛細管柱(75 μm×60 cm，有效分離長度50 cm，河北永年光導纖維廠).

1.2 試劑

乙腈(色譜純，天津市科密歐化學試劑開發中心)，十二烷基硫酸鈉(SDS)(分析純，上海試一化學試劑有限公司)，黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所)，蒙古黃芪購于武漢市德仁堂藥店，經中南民族大學藥學院萬定榮教授鑒定.其它試劑均為分析純，實驗用水均為超純水.

1.3 對照品溶液制備

精密稱取一定量黃芪甲苷，用體積分數50%(下同)的乙醇配制成0.70 mg/mL對照品溶液.

1.4 供試品溶液制備

精密稱取約2 g的黃芪藥材粉末，置于100 mL錐形瓶中，加50%乙醇50 mL，密塞，用超聲—微波協同萃取30 min，放冷后過濾，濾液轉移到50 mL容量瓶內，用50%乙醇定容到刻度，搖勻.取濾液經0. 22 μm微孔濾膜濾過后即得黃芪供試品溶液.

1.5 電泳條件及測試方法

分離電壓20 kV, 進樣壓力(0.5 psi，時間5 s)，溫度25 ℃，分離時間15 min，檢測波長203 nm，運行緩沖液(pH=8.5)組成:20 mmol/L磷酸二氫鈉— 40 mmol/L硼砂—30 mmol/L SDS—10%乙腈.毛細管使用前用NaOH溶液(0.10 mol/L)沖洗2 min、純水沖洗5 min、pH=8.5緩沖溶液沖洗10 min；兩次運行之間分別用純水沖洗3 min和用pH=8.5緩沖溶液沖洗5 min.用黃芪甲苷對照品溶液在波長190～330 nm之間進行二極管陣列掃描，發現檢測波長為203 nm時，對黃芪甲苷的檢測靈敏度最高.

2 結果與討論

2.1 電泳模式的選擇

通過比較在毛細管區帶電泳(CZE)和毛細管膠束電動色譜(MECC)兩種模式下黃芪供試品溶液的電泳分離效果，發現在含有表面活性劑SDS的MECC模式下分離效果較好.

2.2 緩沖溶液濃度對分離的影響

電泳分離過程中，若緩沖溶液電解質濃度過低，分離度達不到要求；緩沖溶液電解質濃度過高，則供試液中酸性成分負電荷密度可能增加，會使遷移時間過長.通過研究不同濃度的硼砂溶液(10～40 mmol/L)、NaH2PO4溶液(10～40 mmol/L) 、SDS溶液(10～40 mmol/L)的混合緩沖溶液對黃芪供試品溶液電泳分離的影響，選擇混合緩沖溶液的組成為:20 mmol/L磷酸二氫鈉—40 mmol/L硼砂—30 mmol/L SDS溶液為背景電解質，電流穩定，峰型較好.

2.3 緩沖溶液pH值對分離的影響

選擇pH值在6.0～9.0之間變化的緩沖液進行實驗，發現緩沖液pH值小時，各組分峰重疊較多；緩沖液pH值大時，峰型差且遷移時間延長.當緩沖液pH值約為8.5時，電泳分離效果較好.

2.4 改性劑用量的影響

以乙腈作緩沖液改性劑，當乙腈在體積分數為5%～20%(v/v)之間變化時，發現隨著乙腈含量的增加，電滲流降低，遷移時間延長.當緩沖液中加入10%乙腈時，電泳分離效果較好，遷移時間適中.

2.5 運行電壓選擇

試驗了分離電壓在15～25 kV之間變化時黃芪甲苷的分離情況，結果表明，電壓為20 kV時分離效果和峰形較好，分離時間長短合適.

2.6 黃芪甲苷峰的定性

將黃芪甲苷對照品溶液和黃芪供試品溶液在毛細管電泳儀上進樣分析(毛細管電泳圖見圖1)，在黃芪甲苷對照品溶液電泳圖中5.26 min處出現一個尖峰，對比二者的遷移時間，可知在黃芪供試品溶液的電泳圖中與其相對的2號峰為黃芪甲苷.在黃芪供試品溶液中加入黃芪甲苷對照品溶液，進樣分析，2號電泳峰增益明顯，證明上述結論正確.

2.7 標準曲線

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液用50%乙醇稀釋成系列濃度的對照品標準溶液，分別進樣，按1.5條件和方法進行測試.測定峰面積積分值，以對照品峰面積積分值為縱坐標(Y)，相應對照品標準溶液濃度(X)為橫坐標繪制標準曲線.通過回歸分析，黃芪甲苷在0.035 0～0.700 0 mg/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系,線性回歸方程為：Y=209 735.472 24X+6 877.674 42，相關系數r= 0.999 2.

圖1 黃芪甲苷對照品溶液電泳圖(上)和黃芪供試品溶液的電泳圖(下)Fig.1 The electropherograms of astragaloside Ⅳ(up)and the electropherograms of the extract of Astragali Radix (low)

2.8 精密度考察

精密吸取1.3黃芪甲苷對照品溶液，按1.5條件和方法進行測試.日內重復進樣5次，日內遷移時間的相對標準偏差(RSD)為0.50%；連續5 d進樣，日間的RSD為0.99%；峰面積的日內測量和日間測量的RSD分別為1.18%和2.65%，達到定量分析精密度的要求.

2.9 樣品測定

分別取5個批次的黃芪藥材，按1.4黃芪供試品溶液制備方法處理后, 按1.5條件和方法進行測試.黃芪中黃芪甲苷的含量測定結果見表1.

表1 黃芪中黃芪甲苷的含量測定結果Table 1 Determination of the Astragaloside Ⅳ of Astragali Radix n=6

2.10 加樣回收率

采用加樣回收法，精確量取1.4黃芪供試品溶液樣品6份，精確加入一定量1.3對照品溶液，進樣，記錄電泳圖，計算平均回收率為98.30%,相對標準偏差(RSD)為1.17% .

3 結 語

本研究分析結果與文獻[4-5]報道的HPLC內標法測定結果的回收率和相對標準偏差(RSD)相近，表明用HPCE法測定黃芪中黃芪甲苷的含量完全符合分析要求.高效毛細管電泳(HPCE)避免了HPLC分析中藥成分分析常遇到一些問題[6]：色譜柱易受復雜中藥成分污染,柱壽命短,且難以再生；色譜柱上沉積的污染物經常以雜質峰的形式出現.本研究結果表明，HPCE方法快速靈敏、精密度好、回收率高、結果準確可靠，可用于黃芪藥材及其制劑的質量控制.

參考文獻:

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社：2010.http://view.china.alibaba.com/cms/promotion/jiadianfhc.html?cosite=pipi_buyer&button_click=top&location=300_250_613dcfc_banner9.

[2] 胡芳弟，趙健雄，封士蘭，等.黃芪的高效液相色譜指紋圖譜及主成分含量測定[J].中藥材,2004,27(11):831-834.

[3] 梁旭明,唐耀書,張小梅. 薄層掃描法測定黃芪膠囊劑中黃芪甲苷的含量[J].時珍國醫國藥，2007，18(1)：22-23.

[4] 裴彩云，王宗權，賈繼明，等. HPLC-ELSD 內標法測定8個產地黃芪藥材、飲片中黃芪甲苷的含量[J].中國中藥雜志，2011，36(14)：1982-1984.

[5] 呂濤，姚希賢，孫澤明. 藥物血清內黃芪甲苷含量測定及其抑制HSCs活化增殖的實驗研究[J].中華中醫藥學刊, 2011,29(12): 2770-2773.

[6] 孫毓慶, 阮婧華, 馬 欣. 中藥的毛細管電泳指紋圖譜研究[J].色譜,2003,21(4 )：303-306.