rt－PA在血腦屏障氧糖剝奪體外模型中對神經細胞保護的研究1）

胡 俊，陳旭輝，吳 軍

重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue－type plasminogen activator，rt－PA）是絲氨酸蛋白酶家族的一員，主要作用是激活纖溶酶原轉變為纖溶酶。rt－PA對血栓的選擇性高，半衰期短，無抗原性；是迄今為止唯一被美國FDA批準用于急性腦梗死的溶栓藥物，可溶解血栓，早期開通閉塞的血管，恢復血供，減少腦組織損傷。歐美國家相繼開始了rt－PA靜脈溶栓治療急性腦梗死的大規模、多中心、隨機對照實驗，美國的NINDS、歐洲ECASS等臨床實驗均證實溶栓治療有明顯療效［1，2］。但是由于rt－PA靜脈溶栓治療時間窗只有3h，極大地限制了其在臨床上的應用。近年有研究表明［3，4］，rt－PA除了參與溶栓過程之外，還可能參與血腦屏障（BBB）后期的血管生成、神經生成和軸突再生。本實驗進一步探討rt－PA對血腦屏障氧糖剝奪后神經細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）、rt－PA、VEGF ELISA、小牛血清、胰蛋白酶、馬血清、考馬斯亮藍、甘氨酸、丙烯酰胺、MTT、相差倒置顯微鏡、振蕩器、酶聯免疫檢測儀、紫外可見分光光度計TU－1810D等。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細胞培養 HUVEC細胞株用含有10%FCS的RPMI－1640培養液，在37℃，5%CO2培養箱培養。細胞貼壁生長，細胞呈菱形。當細胞接近70%～80%融合時以0.25%胰酶＋0.02%EDTA消化液消化后傳代。HUVEC細胞濃度取2×105／mL用于各項實驗。

1.2.2 海馬神經元原代培養 海馬神經元取自C57BL／6新生鼠，75%乙醇消毒 ，取出大腦置于冷的Hanks平衡鹽溶液中，迅速剝離分出兩側海馬組織，轉移至0.25%的胰酶中37℃消化15min。血清終止消化，1 500r／min，4℃離心10min以沉降組織。用冷的10%DMEM清洗組織一次，離心后重懸，吹打使組織成單細胞懸液，調整細胞密度為5×104／mL。接種于多聚鳥氨酸處理的培養瓶、24孔板與96孔板中。培養第2天將DMEM培養液換成神經元培養液（配方如下），每周進行兩次換液。

1.2.3 血腦屏障的建立 利用24孔Transwell培養小室，在培養HUVEC之前，用0.5%明膠包被3μm孔徑的薄膜，用HUVEC細胞含有10%FCS的RPMI－1640培養液中加入含40%培養膠質細胞后的培養液，混合在一起進行BBB的血管上皮細胞培養，使其產生和維護BBB的特性，培養24h后單個細胞形成單層細胞。

1.2.4 氧糖剝奪實驗（OGD） 將惰性混合氣體（5%CO2＋95%N2）供應裝置連接到轉移箱的閥門上，激活轉移箱泵的微調開關以抽真空，當手套伸進手套箱并稍微觸及箱體底部時，關閉真空泵，打開氣閥輸入混合氣體。將溫度設定在37℃，預熱半小時，待用。

1.2.5 rt－PA對神經元活性的作用測定 調整神經元細胞濃度為2×105／mL，接種于96孔培養板中，加入rt－PA，使其濃度分別為40μg／mL、20μg／mL、1 0μg／mL、5μg／mL、2.5 μg／mL、1.25μg／mL、0.625μg／mL和0.312 5μg／mL分別加入到神經元細胞中，100μL／孔，每個rt－PA藥物濃度設4個平行孔，同時設細胞對照，置厭氧培養箱培養7h，另外一組以同樣方式每個rt－PA藥物濃度設4個平行孔，同時設細胞對照，置37℃5%CO2培養箱培養7h，用MTT法進行檢測，每孔加入MTT溶液（5mg／mL），每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度，記錄結果。

1.3 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用卡方檢驗。

2 結 果

2.1 不同濃度rt－PA對非OGD條件下培養的神經細胞活性影響 在非 OGD條件下，高濃度rt－PA（40μg／mL、20μg／mL、10μg／mL、5μg／mL）對神經細胞有毒性作用；而低濃度rt－PA（0.312 5μg／mL）對神經細胞的生長有促進作用。詳見圖1。

圖1 不同濃度rt－PA對非OGD條件下培養的神經細胞活性影響

2.2 不同濃度rt－PA對OGD條件下培養的神經細胞活性影響 在OGD條件下，除高濃度rt－PA（40μg／mL、20μg／mL、10μg／mL、5μg／mL、）對神經細胞有毒性作用外；低濃度rt－PA（0.625μg／mL，0.312 5μg／mL）對神經細胞保護作用。詳見圖2。

圖2 不同濃度rt－PA對OGD條件下培養的神經細胞活性影響

2.3 不同濃度rt－PA對厭氧與非厭氧條件下培養的神經細胞活性影響比較 為更能說明rt－PA對神經細胞的保護作用，在OGD和非OGD條件下，rt－PA對神經細胞的保護作用進行了比較，結果發現，1.25μg／mL，0.625μg／mL，0.312 5μg／

mL三個濃度均無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖3。

圖3 不同濃度rt－PA對厭氧與非厭氧條件下培養的神經細胞活性的影響

3 討 論

重組組織型纖溶酶原激活劑是由血管內皮細胞合成并儲存及釋放的一種絲氨酸蛋白酶，主要的生物學功能是激活纖溶酶原轉變成纖溶酶，纖溶酶將纖維蛋白及血漿凝血因子（如因子Ⅴ／Ⅷ）降解，從而使血管再通。rt－PA也是被美國FDA批準用于治療急性缺血性腦梗死的藥物。對于rt－PA治療缺血性腦梗死的利弊，目前仍有諸多爭議，有的觀點認為rt－PA在溶解血栓之后，會進一步影響血腦屏障的功能，并且導致血腦屏障通透性的開發，例如通過激活基質金屬蛋白酶－9（MMP－9）、NMDA受體等，引發腦出血、腦水腫的發生。還有學者認為rt－PA具有神經毒性作用：①rt－PA通過作用于NMDA型谷氨酸受體的NRⅠ型亞基，導致鈣離子內流的增加，引起神經細胞的破壞，并促進神經元的凋亡［5，6］。②rt－PA 通過激活MMPs，特別是MMP－9的大量激活，MMP－9通過降解細胞外基質（ECM）和血管基底膜，導致血腦屏障的破壞，引起腦水腫和腦出血［7］。③rt－PA誘導低密度脂蛋白受體相關性蛋白（low density lipoprotein receptor－related protein，LRP）的激活，引起血腦屏障的開放，通透性增加。另外，關于rt－PA劑量的選擇，也一直存在著矛盾，歐美建議急性腦梗死靜脈溶栓治療使用0.9mg／kg，而根據亞洲人群的體質，也有觀點建議使用0.6mg／kg［8］。而本研究發現，在不同rt－PA 藥物的濃度作用下，通過采用MTT方法檢測在OGD和非OGD不同條件下神經細胞的活性。結果表明，在非OGD條件下，高濃度rt－PA（40μg／mL、20μg／mL、10μg／mL、5μg／mL）對神經細胞有毒性作用；而低濃度rt－PA（0.312 5μg／mL）對神經細胞生長具有促進作用，與對照組比較有統計學意義（P＜0.01）。在OGD條件下，除高濃度rt－PA（4 0μg／mL、2 0μg／mL、1 0μg／mL、5 μg／mL）對神經細胞有毒性作用外；低濃度rt－PA（0.625 μg／mL，0.312 5μg／mL）對神經細胞有保護作用，與 OGD條件下的神經細胞活性對照，差異均有統計學意義（P＜0.01）。但本實驗還發現在OGD以及非OGD條件下，同時進行rt－PA對神經細胞活性作用的比較，結果發現，1.25μg／mL、0.625μg／mL、0.312 5μg／mL三個濃度均無統計學意義（P＞0.05）。結果證明，rt－PA在高濃度對神經細胞具有毒性作用，而在低濃度時，無論在OGD或者非OGD條件，rt－PA都對神經細胞有保護作用。但rt－PA在血腦屏障氧糖剝奪體外模型中對神經細胞的保護機制，目前仍甚少研究，有研究認為［9］rt－PA通過細胞外信號調節激酶通徑，可修整細胞的凋亡程序，從而達到保護神經細胞的作用，但進一步的研究仍需更多的努力。

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