銀杏葉提取物EGb761抗大鼠腦缺血損傷的作用機制研究*

于永娟 牟芳芳 張澤安△

（1.上海中醫藥大學藥物安全性評價中心，上海 201203；2.上海中醫藥大學解剖教研室，上海201203）

腦缺血缺氧性疾病是老年人多發和常見的一種疾病，由于腦缺血缺氧引起的細胞損傷涉及了多種信號通路異常，目前尚無特效藥物用于臨床。本文旨在通過觀察EGb761對腦缺血大鼠腦細胞中P38/MAPK和MEK/ERK的影響，從形態學和分子水平闡述EGb761的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SD雄性大鼠（300±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號2007000511866。

1.2 試劑 銀杏葉提取物（金納多片，20 mg/片，德國威瑪舒培博士藥廠）。10%水合氯醛溶液：上海國藥集團。TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）：上海國藥集團。Western blot相關試劑盒：購自碧云天，β-Actin： signaling technology company， Cat： #4967。P38：購自武漢博士德生物科技有限公司，BA1325。P-P38：Cell signaling technology company，Cat：#4631。 MEK： Cell signaling technology company，Cat：#9122。 P-MEK： Cell signaling technology company，Cat：#2338。 ERK： Cell signaling technology company，Cat：#4695。 P-ERK： Cell signaling technology company，Cat：#9106。 生物素化二抗：Vector，Cat：BA-1000。ABC： Vector，Cat： PK-6100。 DAB： Vector， Cat： SK-4100。

1.3 分組與給藥 大鼠隨機分為空白對照組9只，假手術組10只，模型組15只，EGb761低劑量（50 mg/kg）組15只和EGb761高劑量（100 mg/kg）組15只。每日1次口服給藥，連續10 d。金納多片用0.5%CMC配成混懸液，現配現用。假手術組給予0.5%CMC。

1.4 模型制備 給藥第11日，制備大腦中動脈線栓（MCAO）腦缺血模型，使用內徑約0.26 mm的尼龍線順著頸內動脈到達大腦中動脈，阻塞血流實現栓塞模型。栓塞60 min后，輕輕抽出線頭約2 cm，實現血流再灌注。造模前后腦血流減少＞75%認為造模成功，腦血流減少＜75%的動物剔除。再灌24 h后，處死動物，取腦，檢測相關指標。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 TTC 染色［1］動物麻醉后腹主動脈放血，立刻取腦，切成厚約2～3 mm的薄片，浸入1%TTC中，37℃染色30 min，觀察腦組織梗死面積。

1.5.2 免疫組化檢測 腦組織固定于 10%甲醛中，24 h后脫水，常規方法制作切片。切片脫蠟，進行熱抗原修復（檸檬酸緩沖液，pH=6.0，沸水中15 min），山羊正常血清封閉，一抗冰箱過夜，之后加入HRP標記的二抗，DAB顯色。拍照，每張切片選取3個視野拍照，照片使用Nikon BR3.5圖像分析軟件分析定量。

1.5.3 Western blot檢測 動物處死后立即取腦，加入蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑和裂解液勻漿，冰上裂解30 min。Bradford法進行蛋白定量，然后取70 μg蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜儀轉膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃過夜，PBS清洗后滴加羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，PBS清洗，加入ECL后使用TANON4500凝膠成像系統檢測蛋白表達。蛋白條帶使用Quantityone軟件進行定量。

1.6 統計學處理 應用SigmaSTAT4.0統計軟件。 數據以（±s）表示，采用單因素方差分析Dunnett法統計。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EGb761對大鼠腦組織梗死體積的影響 見圖1。染成紅色部分為未缺血組織，白色部分為梗死組織。從結果可見，EGb761可劑量依賴性地減少大鼠腦組織梗死面積。

圖1 大鼠腦TTC染色

2.2 EGb761對大鼠腦缺血性組織Caspase-9和Caspase-3的影響 見圖2。與假手術組相比，不論皮質部位，還是海馬部位，模型組動物Caspase-9和Caspase-3陽性細胞數顯著性增多。EGb761各組Caspase-9/3陽性細胞較模型組明顯減少（P＜0.05）。給予EGb761后，陽性細胞數劑量依賴性減少，但是Caspase-3表達僅有高劑量組教模型組具有顯著性減少（P＜0.05），而Caspase-9的表達在EGb761-50和EGb761-100組均顯著性減少（P＜0.05），這些結果表明，EGb761可劑量依賴性抑制凋亡信號傳遞，減少細胞凋亡。

圖2 大鼠腦Caspase-9和Caspase-3免疫組化結果

圖3 大鼠腦皮質P38/P-P38蛋白表達變化

2.3 EGb761對缺血大鼠腦皮質P-P38水平的影響 與假手術組相比，模型組動物皮質，P-P38 的表達顯著上升（P＜0.05，圖3），表明缺血性損傷時P38被激活了。EGb761給藥后，P-P38的表達減少，與模型組相比，P-P38 的表達從模型組的（0.12±0.08）下降到給藥 EGb761-100 后的（0.07±0.03），差異具有統計學意義（P＜ 0.05，圖3）。 本實驗結果表明，EGb761-100 mg/kg 給藥顯著性抑制了P38/MAPK信號分子在腦缺血大鼠腦皮質的激活。但是，EGb761組中P38蛋白與假手術組表達水平相似，無統計學差異 （P＞0.05）。這些數據表明，缺血性損傷能夠直接引起P38/MAPK的磷酸化，從而引發下游信號的傳遞。由此，筆者推測EGb761的神經保護作用與抑制P38/MAPK信號傳導有關。

2.4 EGb761給藥抑制了缺血大鼠腦組織中P-ERK，P-MEK的磷酸化水平 從圖4可見，與假手術組相比，ERK和MEK的總的蛋白水平在模型組和EGb761給藥組均未見明顯變化 （P＞0.05，圖4），而P-ERK的表達在模型組顯著高于假手術組（P＜0.05），分別為（0.05±0.04）和（0.16±0.05）。與模型組相比，P-MEK水平在EGb761各用藥組均有顯著下降（P＜0.05），但是P-ERK僅高劑量組相較模型組有顯著下降（P ＜0.05），從模型組（0.16±0.05）下降至（0.10±0.05）。 P-MEK 的表達相較模型組，各用藥組均顯著性下降（P＜0.05），分別從模型組（1.02±0.04）下降至低劑量組的（0.67±0.20）和高劑量組的（0.74±0.21）。 這些結果表明，腦缺血后，MEK和ERK均被激活，EGb761給藥后，一定程度上抑制了這兩個蛋白激酶的活化。

圖4 大鼠腦皮質MEK/ERK蛋白表達變化

3 討 論

啟動細胞凋亡一般通過兩條途徑，一條是內源性凋亡信號系統，以Caspase-9的激活為標志，另一條外源性凋亡信號通過激活Caspase-8，最終二者均可引起Caspase-3激活，啟動細胞的凋亡［2］。已有實驗證明P38/MAPK途徑的激活會誘導細胞凋亡［3-4］。P38MAPK被磷酸化激活后，可以進一步激活其下游的激酶或多種轉錄因子，如蛋白激酶MAPKAPK2，轉錄因子ATF2，Elk-1等，產生一系列細胞內效應，促進誘導型一氧化氮合酶、選擇素、腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β 等分子表達［5-6］。這些基因表達產物在腦缺血損傷時的神經細胞凋亡、炎性反應等過程中發揮著重要作用，。大量實驗數據也表明使用P38/MAPK的抑制劑可以減少缺血后細胞的凋亡［7］。本研究發現在缺血60 min再灌24 h的大鼠腦缺血區，與假手術組相比，模型組動物P-P38和P-ERK均激活了，而EGb761給藥后，P-P38的表達減少（P＜0.05）。

Takagi等發現［8］，局灶性腦缺血再灌注后 5 min，皮質及海馬的神經元中P38MAPK，再灌注30 min達到高峰，而再灌注后72 h，上述激酶活性增強的區域中可發現凋亡的神經元。表明P38激活促進了凋亡途徑引起損傷。Ma XL等［7］研究發現SB 203580組與對照組相比，可減少缺血引起的心肌細胞死亡，進一步表明缺血性損傷引起的P38激活促進了細胞損傷，而抑制P38活性具有細胞保護作用，但機制未明。Kevin等［9］在沙土鼠腦缺血模型發現，p38/MAPK及其底物ATF2均有變化，MAPKAP2在腦缺血后持續數天活化，缺血后3～4 d酶活性最高，同時海馬區錐狀神經元缺損最多，而JNK1和ERK的活化不明顯。

實驗研究發現在缺血性疾病中，MEK激活的ERK促進了細胞損傷，因為MEK選擇性抑制劑SL327在缺血前15 min會減少64%梗死面積，同時，SL327減少了59%的IL-1β mRNA的表達，但是TNF-α不變。表明MEK抑制劑通過減少IL-1β而神經保護作用［10］。另外，在MCAO造模前30 min和造模后30 min使用ERK的特異性阻斷劑UO126均可減少MCAO后的損傷面積，認為其保護作用是通過抑制了缺血引起的p－ERK1/2激活實現的［11］，MEK/ERK的激活可以促進缺血后TNF-α的表達［12］，這些實驗表明，MEK/ERK通路在腦缺血時的激活促進了炎性因子釋放，從而加重了細胞損傷。通過抑制MEK/ERK的激活，會緩解炎性因子對細胞的損傷，同時直接或間接抑制細胞凋亡，發揮缺血后的神經保護作用。

本實驗中大鼠腦缺血后P-ERK表達明顯增加，與QiaoH等［13-14］的結果相同，而EGB761用藥后，與大鼠大腦中動脈栓塞再灌模型組相比，腦組織梗死面積減少，凋亡標記TUNEL染色陽性的細胞顯著性減少，Caspase-3表達減少。Caspase-3是啟動凋亡程序的重要的蛋白分子，Caspase-3陽性細胞數的減少充分論證了EGb761可以抑制細胞的凋亡，同時在大鼠缺血后皮質發現P-MEK和P-ERK在EGb761給藥組顯著下降（圖4）。由此，筆者認為，EGb761通過抑制MEK/ERK的激活，阻斷了內源性凋亡通路的激活，從而減少了細胞的凋亡。

本實驗從形態學和蛋白表達水平研究了EGb761對腦缺血的神經保護作用及涉及的信號通路。從結果可知，EGb761可以通過抑制細胞凋亡發揮了缺血性損傷中的細胞保護作用，其作用機理涉及了凋亡通路，P38/MAPK和MEK/ERK信號通路。由于EGb761的多靶點藥理作用和對細胞無毒性的特點，本研究認為其是一種可以有效預防和治療腦缺血的中藥，具有開發前景。

致謝：感謝上海中醫藥大學安評中心老師和同學們的無私幫助。

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