姜黃素對低氧誘導的HaCaT細胞增殖以及HIF-1α蛋白的影響*

于春水 蘇江維 胡 珍

（川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637000）

姜黃素（curcumin）是從姜科植物姜黃中提取的一種酚類物質。動物實驗表明，姜黃素具有抗氧化、抗感染、抗炎及抑制腫瘤生長等作用［1］。國外學者研究發現，姜黃素能夠抑制膀胱癌T24細胞增殖，阻止該細胞在G2-M期，其作用呈濃度依賴性，同時姜黃素還具有下調T24細胞的細胞周期蛋白A（cyclinA），上調細胞周期素依賴激酶抑制劑P21 WAF1/CIP1，降低環氧酶-2 mRNA及其蛋白表達的作用［2］。本研究將不同濃度的姜黃素作用于培養的HaCaT細胞，觀察其對HaCaT細胞增殖及在缺氧培養下對HaCaT細胞中低氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）蛋白表達的影響，探討姜黃素對HaCaT細胞增殖及HIF-1α的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HaCaT細胞株（武漢大學典型物保藏中心），HIF-1α兔抗人單克隆抗體（Sigma公司）。姜黃素（Sigma公司），純度＞96%，用DMSO稀釋，等量分裝，-20℃保存。用時用培養液稀釋為 0.1%（v/v），以不影響細胞的生長。

1.2 姜黃素對HaCaT細胞增殖抑制的檢測 （MTT法） HaCaT細胞以DMEM培養基常規培養，每2～3日換液、傳代。取對數期生長的HaCaT細胞，以1.0×104/mL接種于96孔培養板中，每孔100 μL，24 h 后棄培養液，處理組細胞分別加入 10、20、30 μmol/L的姜黃素，每孔100 μL，對照組僅用DMEM處理，每孔均為100μL，設3個復孔。常規設立對照組，加入與姜黃素等體積的培養液于對照組內。于培養24 h時，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h，棄上清，然后每孔加入 DMSO 100 μL，沉淀充分溶解后，用酶標儀測定570 nm波長下OD值，生長抑制率＝（1-實驗組OD值/空白組OD值）×100%。

1.3 HaCaT細胞的缺氧處理與免疫組化檢測 將HaCaT細胞的單細胞混懸液以每孔1×104的密度小心接種至放有蓋玻片的6孔板內，然后每孔加入2.0 mL的DMEM培養液。培養條件為：50 U/mL 青霉素，50 mg/mL 鏈霉素，1.25 mg/mL 兩性霉素 B，于37℃，5%CO2的孵箱內培養。待細胞長至60%融合時，再將細胞置于 37℃，含有1%O2，5%CO2和94%N2的缺氧培養箱中繼續培養24 h。之后，處理組細胞分別加入終濃度為10、20、30 μmol/L的姜黃素，每孔 2000 μL，對照組僅用 DMEM處理，培養48 h后取出蓋玻片做隨后的實驗，每組均設3個復孔。在用姜黃素處理HaCaT細胞時，保持避光。HIF-1α蛋白在HaCaT細胞的檢測，實驗結束，取出上述蓋玻片，按照常規免疫組化操作步驟進行，陽性細胞為有棕黃色顆粒狀沉淀。免疫組化結果采用德國LeicaQ570公司的圖像分析儀及圖像分析系統軟件對其進行半定量分析，每張蓋玻片隨機選取3個視野，每個視野選取10個細胞測量其平均灰度值，圖像分為0～255灰度級，染色結果越淡，灰度值越高。

2 結 果

2.1 不同濃度的姜黃素對HaCaT細胞增殖的影響 見表1。姜黃素對HaCaT細胞增殖有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，抑制作用加強，并呈顯著的量效依賴型關系。

表1 不同濃度姜黃素對HaCaT細胞增殖的影響（n=3，±s）

表1 不同濃度姜黃素對HaCaT細胞增殖的影響（n=3，±s）

與對照組比較，*P＜0.01。 下同。

組 別 OD值對照組 1.234±0.03姜黃素 10 μmol/L 組 0.532±0.05*姜黃素 20 μmol/L 組 0.454±0.04*姜黃素 30 μmol/L 組 0.408±0.02*

2.2 HaCaT細胞缺氧培養后HIF-1α蛋白表達比較 HaCaT細胞在缺氧培養后，HIF-1α蛋白的免疫組化著色在對照組呈陽性表達（圖1）；而在姜黃素處理后，HaCaT細胞中HIF-1α蛋白的表達減少，同時隨著姜黃素濃度的增加，HaCaT細胞中HIF-1α蛋白的表達逐漸減弱，染色顯示，陽性主要位于細胞的胞漿內。姜黃各組與對照組比較，有顯著差異（P＜0.01），并且灰度分析的結果與光學顯微鏡的觀察結果相一致（表2）。

圖1 各組HaCaT細胞缺氧培養后HIF-1α蛋白表達（×200）

表2 姜黃素對HaCaT細胞中HIF-1α蛋白表達影響（n=3，±s）

表2 姜黃素對HaCaT細胞中HIF-1α蛋白表達影響（n=3，±s）

組 別 灰度值對照組 131.12±3.21姜黃素 10 μmol/L 組 192.13±3.13*姜黃素 20 μmol/L 組 201.16±2.14*姜黃素 30 μmol/L 組 240.13±4.15*

3 討 論

有研究發現，姜黃素可抑制體內外腫瘤細胞的生長，因此，姜黃素在防治腫瘤等方面有明顯的作用，其良好的抗突變和抗癌作用使其成為一種很有應用前景的抗癌藥物［3］。而銀屑病角質形成細胞的異常增殖在某種程度上與腫瘤細胞的表現類似。

HIF-1α是HIF-1異源二聚體結構之一，屬于bHLH-PAS家族成員。有研究報道，HIF-1α在銀屑病皮損中的表皮角質形成細胞及其真皮乳頭層毛細血管內皮細胞中呈過度表達［4］。近來的研究顯示，在缺氧情況下，HIF-1α在HaCaT細胞的表達增高［5］。

本研究結果顯示，以不同濃度的姜黃素作用于HaCaT細胞后均能抑制培養的HaCaT細胞增殖，并且結果呈現量效依賴關系，同時，隨著姜黃素濃度的增加其抑制作用增強，該結果與對照組相比具有顯著差異 （P＜0.01）；姜黃素能抑制缺氧培養的HaCaT細胞HIF-1α蛋白的表達，并呈量效依賴關系，與對照組相比，有顯著差異（P＜0.01）。有研究認為，銀屑病皮損區可能存在局域缺氧［6］，銀屑病皮損表皮HIF-1α表達增高，認為可能與皮損局部缺氧有關［7］。因此，缺氧培養的HaCaT細胞與銀屑病、腫瘤細胞的情況有些類似。

有研究報道，HIF-1α與胸腺瘤的發生有關系［8］。銀屑病和惡性腫瘤都表現為具有特征性的細胞過度增殖和局域性的缺氧表現［9］。本實驗結果顯示，姜黃素具有抑制HaCaT細胞的增殖及HIF-1α蛋白的表達的作用，如用于銀屑病治療中，可以改善銀屑病表皮的異常增殖現象。因此，姜黃素可能對于表現為表皮異常增殖的一類疾病效果滿意。在銀屑病中局部表皮細胞的異常增殖增加了該處的氧的消耗，而棘層的肥厚可以進一步導致皮損處氧供應的障礙。有研究發現，在缺氧條件下，HaCaT細胞表達HIF-1α僅是蛋白水平的增加，而在mRNA水平其表達是穩定的［9］。這一結論與我們的研究結果相一致。姜黃素對HaCaT細胞中的HIF-1α mRNA具體作用如何，有待進一步深入的研究。由于HaCaT細胞在缺氧培養的條件下與銀屑病表皮所處的情況有些類似，而本實驗結果顯示，姜黃素具有抑制缺氧培養的HaCaT細胞中HIF-1α蛋白表達的作用。因此，筆者認為，姜黃素可推薦用于銀屑病以及表現為表皮異常增殖的一類疾病的治療，使其異常增殖的表皮得以恢復正常。

［1］龍明智，陳磊磊.姜黃素的藥理作用［J］.國外醫學：中醫中藥分冊，2003，25（5）：270-275.

［2］Park C，Kim GY，Kim GD，et al.Induction of G2/Marrest and inhibition of cyclooxygenase 2 activity by curcumin in human bladder cancer T24cells［J］.Oncology reports， 2006， 15（5）：1225-1228.

［3］許建華，趙蓉，柯丹如，等.姜黃素的體外抗癌作用及其水溶液的穩定性［J］.中藥藥理與臨床，1998，14（5）：415-417.

［4］Rosenberger C，Solovan C，Rosenberger A，et al.Upregulation of hypoxia-inducible factors in normal and psoriatic skin［J］.J Invest Dermatol，2007， 127（10）：2445-2452.

［5］Nys K，Van LA，Michiel C，et al.A p38 （MAPK）/HIF-1 pathway initiated by UVB irradiation is required to induce Noxa and apoptosis of human keratinocytes［J］.J Invest Dermatol，2010， 130（9）：2269-2276.

［6］Tovar LE，Cancino JC，Garsia VF，et al.Underexpression of VHL and over-expression of HDAC-1，HIF-l alpha，LL-37，and IAP-2 in affected skin biopsies of patients with psoriasis［J］.Int J Dermatol， 2007，46（3）：239-246.

［7］楊海龍，栗玉珍，孫瑞，等.HIF-1α、VEGF在銀屑病皮損中的表達及意義［J］.醫學信息，2011，24（1）：340-342.

［8］王湛，黃壯士，蘇彥河，等.HIF-1α、Caspase-3及 Survivin在胸腺瘤中的表達及意義［J］.中華臨床醫師雜志：電子版，2009，3（5）：717-722.

［9］楊井，陶娟，李延，等.缺氧對 HaCaT細胞 HIF-1α、GLUT-1表達的影響及與細胞增殖的關系［J］.中國皮膚性病學雜志，2009，23（10）：621-623.