黃芪注射液合川芎嗪注射液治療類風濕關節炎的作用機理研究*

陳利鋒 吳 娟 何東初 吳江平

（廣州軍區武漢總醫院，湖北 武漢 430070）

中醫學認為，類風濕關節炎乃正氣不足，風寒濕三氣雜至而為之［1］，病機以經脈閉阻、氣血不暢為主?；ぜ毎鲋钞惓：脱仔约毎櫴穷愶L濕關節炎（RA）發病的關鍵，抑制滑膜細胞增殖和炎性細胞因子分泌對RA的防治有重要價值［2］。本研究采用與人類RA臨床特征接近的佐劑性關節炎（AA）大鼠模型，從疾病的發生發展、組織形態、細胞因子巨噬細胞移動抑制因子（MIF）、白細胞介素（IL）-17、γ 干擾素（INF-γ）及血管內皮生長因子（VEGF）的表達水平等方面進行觀察，探討黃芪注射液與川芎嗪注射液協同作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物 70只健康雄性Wistar大鼠，清潔級，體質量180～200 g，湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK （鄂）2008-0005，飼養于中國人民解放軍廣州軍區武漢總醫院醫學實驗動物中心。

1.2 試藥與儀器 黃芪注射液 （規格10 mL/支，相當于生藥20 g，黑龍江省珍寶島制藥有限公司，批號20101112），川芎嗪注射液（規格2 mL/支，鄭州卓峰制藥有限公司，批號0110112），甲氨蝶呤片（MTX）（規格2.5 mg/片，上海醫藥集團有限公司信誼制藥總廠，批號 090528），雷公藤多苷片（TPT）（規格 10 mg/片，黃石飛云制藥有限公司，批號20100901）。完全弗氏佐劑（美國SIGMA 公 司 ）。 MIF、INF-17、VEGF、INF-γ 酶 聯 免 疫 試 劑 盒（R&D公司進口分裝，20090312）。磷酸鹽緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司）。Annexin V/FITC細胞凋亡試劑盒（碧云天生物技術研究所，編號 C1062），流式細胞儀（FACS Caliur，美國BD公司）。BMJ-1生物組織包埋機、QPJ-1C石蠟切片機（天津航空機電公司）；AXIOSKOP2PLUS光學顯微鏡。RaytoRT-6500酶標儀（芬蘭Labsystems公司）。

1.3 造模及分組 將大鼠飼喂1周后，稱體質量，除正常組10只外，剩余大鼠造模。選取大鼠的右足墊，在無菌條件下皮內注射0.1 mL弗氏完全佐劑，正常對照組在同一部位，同樣方法注射0.1mL 0.9%氯化鈉注射液。造模后60只大鼠隨機分為正常組、模型組、黃芪組、川芎組、配伍組、MTX組、雷公藤組，每組10只。

1.4 給藥方法 造模1周后開始給藥，正常組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液。黃芪組將黃芪注射液配制成3.6 g/mL的溶液。川芎組將鹽酸川芎嗪注射液配制成14.4 mg/mL的溶液。配伍組用0.9%氯化鈉注射液將黃芪注射液與川芎嗪注射液混合配制成每毫升含黃芪3.6 g、川芎嗪14.4 mg的溶液。MTX組將MTX研成細末，加0.9%氯化鈉注射液配置成1.8 mg/mL的混懸液。雷公藤組將雷公藤多苷片研制成末，配制成9 mg/mL的混懸液。各組均按10 mL/kg灌胃，每日1次。給藥3周后處死大鼠，期間觀察大鼠一般情況，稱量并記錄體質量。

1.5 標本采集與檢測 （1）足趾腫脹程度的測量。造模前用足跖容積測量儀測量各組右后足的足容積，造模后密切觀察足趾腫脹情況，并分別于造模后第7、14、21、28日測量右后足足容積，觀察治療藥物對大鼠足趾腫脹的影響。（2）細胞因子MIF、IL-17、INF-γ、VEGF的檢測。各大鼠斷頭取血4～5 mL于促凝管中，2000 r/min離心15 min，移取上清液并分裝，置于-60℃凍存備用；采用酶聯免疫吸附法，實驗操作嚴格按各細胞因子檢測試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理 應用SPSS15.0統計軟件。實驗數據以（±s）表示。采用t檢驗及方差分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠一般狀況 見表1。整個實驗過程中，正常組大鼠狀態良好，毛光色潤，動作靈敏，反應迅速。模型組大鼠精神飲食、活動能力、反應情況均降低。造模前各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模1周后各組大鼠體質量與正常組比較，均明顯下降（P＜0.05）。給藥3周后，配伍組、MTX組及雷公藤組大鼠體質量增長較模型組明顯（P＜0.05），配伍組體質量與MTX、雷公藤組、正常組相當（P＞0.05），優于黃芪、川芎組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠體質量比較（g，±s）

表1 各組大鼠體質量比較（g，±s）

與正常組同時期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同時期比較，△P＜0.05；與配伍組同時期比較，▲P＜0.05。下同。

組 別 n 造模前 造模后1周 給藥后3周正常組 10 228.4±14.9 259.1±17.22 310.8±21.55模型組 10 226.5±13.3 230.6±15.44* 250.9±19.34黃芪組 10 227.4±15.6 231.5±13.36* 271.2±16.88▲川芎組 10 225.9±11.2 233.2±14.22* 269.6±17.57▲配伍組 10 226.3±12.7 232.3±12.55* 308.5±22.34△MTX 組 10 224.8±13.4 234.7±15.66* 305.1±11.44△雷公藤組 10 227.1±14.1 233.9±18.24* 306.9±20.65△

2.2 大鼠足趾腫脹度比較 見表2。造模前各組大鼠右后足趾腫脹度比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后肉眼觀察，模型大鼠右后足趾和踝關節紅腫明顯并逐日加重。造模后1周，各組大鼠右后足趾與正常組比較，腫脹度明顯增高（P＜0.05），說明造模成功；造模后3周，給藥組大鼠關節腫脹度與模型組比較明顯緩解，差異有統計學意義（P＜0.05），配伍組與雷公藤組效果相當（P＞0.05），優于黃芪、川芎組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠右后足趾腫脹度比較（mL，±s）

表2 各組大鼠右后足趾腫脹度比較（mL，±s）

組 別 n 造模前 造模后1周 給藥后3周正常組 10 1.05±0.04 1.07±0.02 1.10±0.05模型組 10 1.06±0.08 2.25±0.12* 2.23±0.14黃芪組 10 1.04±0.06 2.26±0.02* 1.87±0.16△▲川芎組 10 1.08±0.11 2.29±0.03* 1.91±0.11△▲配伍組 10 1.05±0.12 2.33±0.13* 1.63±0.21△MTX 組 10 1.07±0.08 2.30±0.11* 1.47±0.07△雷公藤組 10 1.06±0.05 2.28±0.15* 1.61±0.19△

2.3 各組細胞因子 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF含量比較 見表3。 造模后 1 周各組大鼠血清 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF 的含量與正常組比較明顯增高（P＜0.01），說明造模成功，大鼠炎性反應明確。各給藥組均可下調AA大鼠血清中MIF、IL-17、INF-γ、VEGF的含量 （P＜0.05），其中配伍組優于黃芪、川芎組 （P＜0.05），IL-17與雷公藤組效果相當。說明配伍組能明顯降低促炎癥細胞因子的含量，以減輕AA大鼠炎癥反應，使關節損傷逐漸減輕。

表3 各組血清 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF 水平比較（±s）

表3 各組血清 MIF、IL-17、INF-γ、VEGF 水平比較（±s）

與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與配伍組比較，▲P＜0.05。

組 別 n IL-17（pg/mL） VEGF（ng/L）正常組 10 4.99±0.30△ 86.40±8.46△模型組 10 25.60±0.84** 401.04±20.86**黃芪組 10 19.73±1.14**△▲ 240.33±12.09**△▲川芎組 10 21.93±1.73**△▲ 252.37±15.72**△▲配伍組 10 15.13±0.98**△ 157.51±14.01**△MTX 組 10 9.00±1.76**△▲ 106.54±16.07**△▲雷公藤組 10 15.01±1.58**△ 184.17±8.01**△▲MIF（μg/L） INF-γ（ng/L）5.50±0.44△ 40.34±16.33△22.08±0.99** 283.53±16.76**15.89±0.91**△▲ 183.29±4.04**△▲16.01±1.09**△▲ 196.09±9.13**△▲12.26±0.76**△ 145.81±7.36**△9.25±0.60**△▲ 90.98±18.16**△▲14.57±0.61**△▲ 166.09±13.55**△▲

3 討 論

RA以周圍關節的對稱性炎癥為主要特征，屬中醫學 “痹證”范疇，又有“頑痹”、“歷節風”之稱［3］。 目前西醫治療主要使用非甾體抗炎藥、糖皮質激素和免疫抑制劑，這些藥物服藥時間長，毒副作用大；而中醫藥治療RA具有一定優勢，療效肯定，毒副作用小，具有控制炎癥和免疫調節等多方面的綜合作用［4］。

黃芪注射液中黃芪具有補氣升陽、益衛固表、托毒生肌、利水消腫之功，有促進細胞因子的分泌及機體免疫的功能，同時又可抗病毒、減少炎癥滲出、提高膠原纖維的彈性［5］。川芎嗪是川芎的主要活血成分之一，其對多種細胞因子、炎性介質都有抑制作用。兩者合用，即可益氣扶正行血，又能活血舒筋經絡，在臨床治療中取得了一定的療效。前期研究已證實，該配伍能降低AA大鼠滑膜細胞的凋亡率，降低血清細胞因子腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-6的水平［6］。本實驗中加大藥物的劑量及質量濃度，進一步探討其對AA大鼠的影響及作用機制。

大鼠體質量作為一個實驗指標，可以反映藥物的安全性及該藥對消化系統的影響，同時大鼠反應度、活動度等一般情況也可作為藥物整體療效的側面反映。MIF是一個具有廣泛生物學活性的細胞因子，它在基因水平同RA存在相關性，通過促進RA的炎癥反應、滑膜組織增生和關節損傷3個方面參與RA的發病，是RA的一個潛在的治療靶點［7］。VEGF通過與其受體特異性作用于血管內皮細胞，促進血管內皮的增生和新生血管的形成、參與炎癥反應的形成和發展［8］。IL-17能上調血VEGF的水平，增加 VEGF mRNA的表達［9］。INF-γ增強 NK細胞的活性，刺激并增強了炎癥反應［10］。這些致炎性細胞因子在RA的發病及病情發展中相互作用，形成一個復雜的網絡，直接或間接促進血管的增生、血管翳的形成，可作為RA病情活動的參考指標。

結果表明，該配伍能改善AA大鼠的一般病變情況，包括體質量、精神狀態、活動能力以及關節的腫脹程度；顯著降低血清中促炎細胞因子MIF、IL-17、INF-γ及VEGF的含量。說明黃芪聯合川芎嗪注射液可以通過抑制AA大鼠成纖維樣滑膜細胞的增生及炎性細胞因子的分泌，減輕AA大鼠關節的破壞作用，而且對AA大鼠的生長無不良影響，體現了組方“扶正祛邪”的配伍原理，為證實該復方的抗炎作用提供實驗室依據，同時具有一定的臨床實踐意義。

［1］姚茹冰，蔡輝，郭郡浩.論血瘀與類風濕關節炎發病及治療的相關性［J］.河北中醫，2009，31（5）：771-772.

［2］邱玉珍，張愛華.中西醫治療類風濕性關節炎近況［J］.中國中醫急癥，2008，17（1）：98-100.

［3］張皖東，趙宏艷，呂誠，等.類風濕性關節炎的中醫藥研究進展［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2002，12（9）：714-719.

［4］李寶麗，莊鴻賢.中醫藥治療類風濕關節炎的思路與方法［J］.中醫雜志，2002，43（5）：385-387.

［5］徐建生，楊興易，陳德昌，等.黃芪抑制心肺復蘇后大鼠肝細胞凋亡的實驗研究［J］.中華急診醫學雜志，2005，14（4）：294-296.

［6］陳利鋒，潘立文，趙映前.益氣活血法對AA大鼠滑膜細胞凋亡及血清細胞因子的影響［J］.湖北中醫學院學報，2010，12（6）：3-5.

［7］李秋麗，陸融，姚智.巨噬細胞移動抑制因子在類風濕性關節炎中的地位和作用［J］.國際免疫學雜志，2007，3（5）：300-302.

［8］韓曼麗，楊學文，高峰，等.VEGF及其受體與類風濕關節炎相關性研究進展［J］.山東醫藥，2009，49（15）：117-118.

［9］丁琴，何東儀.Th-17與類風濕關節炎研究進展［J］.上海預防醫學雜志，2009，21（6）：281-282.

［10］余宜龍，聶宇.細胞因子與類風濕關節炎［J］.淮海醫藥，2004，22（6）：532-534.