土貝母皂苷Ⅱ對誘導性肝癌大鼠肝細胞周期的影響*

晁 旭 崔亞亞 成 曉 魏敏慧 黨 琳 史海龍 楊新捷

（1.陜西中醫學院基礎醫學院，陜西 咸陽 712046；2.西北大學生命科學學院，陜西 西安710069）

土貝母為葫蘆科植物，是一種廣泛應用的傳統中藥［1］，具有散結、消腫、解毒之功效［2］。采用現代提取工藝和分析方法已經從土貝母分離出14種皂苷，其中土貝母皂苷Ⅰ、Ⅱ被證明具有抗腫瘤，抗炎和提高免疫力的作用［3-4］。研究發現，土貝母皂苷Ⅱ是最有希望用于臨床試驗的化合物［5］。本研究應用流式細胞術（FCM）分析土貝母皂苷Ⅱ對癌前病變肝細胞DNA合成和細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 Wistar大鼠，購于第四軍醫大學；二乙基亞硝胺（DEN）購自Sigma公司。土貝母皂苷Ⅱ由陜西中醫學院中藥教研室提供。

1.2 造模與給藥 將大鼠隨機分為對照組、模型組和治療組，每組6只。對照組動物正常飼喂，模型組與治療組于第1日按200 mg/kg體質量經腹腔一次性注射1%DEN，10 d后按2 mL/kg體質量第1次口服促癌劑（50%CCl4-橄欖油溶液），以后每隔3 d口服1次CCl4。實驗第4周起，治療組同時每日按200 mg/kg體質量灌服土貝母皂苷Ⅱ，共20 d。

1.3 標本采集與檢測 （1）第16周取材進行肝細胞分離，按Seglen［6］改良法進行操作。大鼠經腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，暴露肝臟，門靜脈插管，在無菌條件下以恒溫灌流泵先后灌注沖洗液和0.05%Ⅰ型膠原酶溶液各15 min。（2）收集對照組和實驗組細胞，用磷酸鹽緩沖液 （PBS）洗滌后，將細胞重懸于0.3 mL PBS，迅速注入預冷的75%乙醇，固定。測定時用PBS洗滌去掉乙醇，將細胞重懸于0.3 mL PBS中；加入0.6 mL碘化丙啶溶液，4℃避光染色15 min以上，經50 μm尼龍網過濾后，并以人末梢血淋巴細胞作為內參標準，用EPIC Scoulter流式細胞儀分析細胞DNA含量，并分析細胞周期。

2 結 果

見表1。與對照組比較，模型組動物處于G1/G0期肝細胞顯著增加（P＜0.05），而 S 期細胞數明顯減少（P＜0.01）。 與模型組相比，治療組肝細胞處于 G1/G0期肝細胞顯著增加（P＜0.05），與對照無明顯差別；而S期細胞數也恢復至正常水平。

表1 各組動物肝臟細胞G1/G0期及S期細胞數比較（%，±s）

表1 各組動物肝臟細胞G1/G0期及S期細胞數比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組治療后比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 S期 G期對照組 5.53±1.34 28.52±2.15 n G1/G0期6 65.95±4.32模型組 18.08±1.02△△ 32.46±2.78 6 49.3±3.87△治療組 6 61.08±2.28* 7.82±2.78** 31.1±2.97

3 討 論

本實驗用FCM的DNA分析技術探討了土貝母皂苷Ⅱ誘導細胞分化的機制，實驗結果顯示肝細胞在正常狀態下，絕大多數處于G0期，極少數處于S期。模型組動物經DEN啟動癌變后，使處于G1/G0期的肝細胞進入S期，G1/G0期細胞數減少，S期細胞數明顯高于對照組，提示其DNA合成旺盛。治療組治療后的S期細胞較模型組明顯減少，而G1/G0期細胞增多，說明土貝母皂苷Ⅱ可以阻止肝細胞從G1期向S期進程，造成G1期細胞的堆積。研究表明，如細胞被阻斷在G1期，更能有效地控制腫瘤的增殖［7］。總之，本研究結果顯示，土貝母皂苷Ⅱ對腫瘤的生長有顯著的抑制作用，而且可能是通過阻滯腫瘤細胞滯留于G1期，從而改變了腫瘤細胞的分裂過程，抑制了腫瘤細胞的增殖。

［1］中國科學院植物志編輯委員會.中國植物志［M］.北京：科學出版社，1986：105-128.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2000年版：一部［M］.北京：化學工業出版社，2000：143.

［3］YuL J，Ma RD，Wang YQ，et al.Potent antitumor activity and low toxicity of tubeimoside Ⅰ isolated from Bolbostemma paniculatum ［J］.Planta Med，1994，60（4）：204-208.

［4］Yu LJ，Yu TX，Ma RD.Inhibition of the tumor promoting action of 12-O-tetradecanoylphorbo l-13-acetate by tubeimosideⅢisolated from Bolbostemma paniculatum［J］.Carcinogenesis，1995，16（12）：3045-3048.

［5］楊萍，于廷曦，馬潤娣，等.土貝母皂苷誘導人宮頸癌Hela細胞周期阻滯和細胞凋亡［J］.癌癥，2002，21（4）：346-350.

［6］Seglen PO.Preparation of isolated rat liver cells.In：Prescott DM.Methodsin Cell Biology［M］.New York：Academic Press，1987：29-83.

［7］楊兼輝.細胞動力學與腫瘤藥物治療.朱世能.腫瘤基礎理論［M］.上海：上海科學技術出版社，1986：177-180.