微量樣品中喜樹堿含量的高效液相色譜測定1)

王 軼 吳 瑩 王 洋 閻秀峰

(東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心/東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室(東北林業大學)，哈爾濱，150040)

喜樹(Camptotheca acuminataDecne)是我國特有的多年生亞熱帶落葉闊葉樹種，屬于珙桐科(Nyssaceae)喜樹屬，主要分布于長江流域及西南各省，因其次生代謝產物喜樹堿具有良好的抗腫瘤活性而受到人們的廣泛關注［1］。

一些叢枝菌根真菌能夠侵染喜樹的細根并與之共生形成叢枝菌根，有研究表明:喜樹幼苗中喜樹堿含量的變化與菌根真菌侵染及菌根形成過程具有相關性［2］。為了深入探討喜樹堿與共生關系及過程的相關機理，需要對喜樹幼苗不同級別細根中的喜樹堿進行精細分析，測定微小根段中的喜樹堿含量。然而，目前常用的基于紫外檢測器的高效液相色譜方法測定喜樹堿含量［3－5］，實驗操作中樣品質量通常為1～2 g喜樹干樣，所需樣品量大且靈敏度不高，無法滿足上述研究工作需求。

借助于喜樹堿具有自發熒光的特性，作者建立了基于熒光檢測器的喜樹堿含量高效液相色譜測定方法，樣品量可以降低至2 mg(干質量)，可以滿足微量植物材料中喜樹堿含量的精確測定。

1 材料與方法

儀器:高效液相色譜系統，包括515型單泵、717型自動進樣器、2475型熒光檢測器(美國Waters公司);Sorvall Legend Micro17型離心機(美國Thermo公司);H—H—2數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);Sartorius BT25S電子分析天平(精度0.01 mg);Bransonic—321超聲波清洗機。

實驗材料:選取成熟飽滿的喜樹種子(來源于四川省金堂縣)，用0.5%的 KMnO4浸泡消毒0.5 h，無菌水洗凈后，播入經過121℃滅菌2 h的細沙中催芽。待有側根生成后栽植于已滅菌的花盆中，每盆1株，盆中基質為土壤與河沙混合物(體積比3∶1，過2 mm篩，混合后121℃滅菌2 h)。移苗后于自動控制溫室中培養，溫室為自然采光，晝夜溫度自然過渡(18～28℃)。40 d后對喜樹幼苗根、莖、葉、子葉及全株分別采樣，樣品烘干后用于喜樹堿含量測定。

試劑與藥品:喜樹堿對照品(批號:080510)由哈爾濱峰源高科技開發有限公司提供，經HPLC測定純度大于99%。乙腈為色譜純(Fisher公司)，娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。其他試劑均為分析純。

對照品儲備液的制備:精密稱取喜樹堿標準品1 mg置于50 mL容量瓶中，加乙腈超聲使其溶解，待冷卻后再用乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成對照品儲備液(20 mg·L－1)。將對照品儲備液分裝后，于冰箱中－80℃保存備用。

樣品溶液的制備:取干燥至恒質量的喜數幼苗葉片材料于研缽中研磨成粉末，精密稱取2 mg喜樹葉粉置于5 mL容量瓶中，加入4 mL 61%乙醇，50℃下超聲提取10 min后取出，冷卻至室溫后定容。搖勻后經微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取濾液作為樣品溶液。

2 結果與分析

波長選擇與HPLC色譜條件確定:以質量濃度為1 mg·L－1的喜樹堿標準品溶液，摸索喜樹堿熒光檢測的最佳激發波長和發射波長。首先，以喜樹堿的最大紫外吸收波長作為激發波長，掃描喜樹堿熒光的發射波長;然后，以所得的最大發射波長，進一步掃描激發波長;如此反復，最終確定最佳熒光檢測條件。結果顯示:針對喜樹堿的最佳激發波長為380 nm，發射波長為553 nm。

經試驗，確定HPLC色譜條件為:Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈 ∶水(體積比4 ∶6)為流動相進行等度洗脫;流速 1.0 mL·min－1;熒光檢測激發波長380 nm，發射波長553 nm;進樣量20 μL。對照品和樣品色譜圖見圖1。

線性關系考察:取對照品儲備液(20 mg·L－1)準確稀釋成為20、40、80、160、200、320、400、800 μg·L－1的標準對照品溶液，按照本文確定的色譜條件進樣分析。以對照品質量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=5 968.6X+2 447.9，r=0.999 6，喜樹堿溶液質量濃度在20～800 μg·L－1范圍內，與峰面積的線性關系良好。

精密度試驗:取喜樹葉片材料，按本文的方法制備樣品溶液。吸取同一份樣品溶液，按本文確定的色譜條件連續進樣6次，峰面積的相對標準偏差為1.5%，精密度良好。

穩定性試驗:取喜樹葉片材料，按本文的方法制備樣品溶液，于室溫下分別放置 0、2、4、8、12、24 h后進樣分析，峰面積的相對標準偏差為3.8%。表明:樣品溶液在24 h內，測定結果基本保持穩定。

圖1 喜樹堿標準品及喜樹幼苗樣品HPLC色譜圖

重復性試驗:取喜樹葉片材料研磨、混勻后，精密稱取6份;按本文的方法制備樣品溶液;按本文確定的色譜條件進樣分析。計算得:喜樹堿的平均質量分數為 0.911 mg·g－1，相對標準偏差為 2.4%。重復性良好。

加樣回收率試驗:精密稱取6份已知喜樹堿質量分數(0.911 mg·g－1)的喜樹葉片粉末各 1 mg，分別加入喜樹堿對照品儲備液(20 mg·L－1)45.6 μL(加入量0.912 μg)，按本文的方法制備樣品后，按照本文確定的色譜條件進樣分析。喜樹堿的平均回收率為98.41%，相對標準偏差為1.88%(見表1)。

表1 喜樹葉片中喜樹堿的加樣回收率

樣品測定:準確量取喜樹幼苗根、莖、葉、子葉和全株的樣品各3份，按本文的方法制備樣品，按照本文確定的色譜條件進樣分析，計算喜樹堿質量分數(見表2)。無論是喜樹堿質量分數較高的葉片樣品，還是質量分數低一些的根樣品，測定結果的相對標準偏差均較小。

表2 喜樹幼苗中喜樹堿含量(n=3)

3 結論與討論

本實驗建立了一種基于HPLC—熒光檢測的微量喜樹植物材料中喜樹堿含量的測定方法，只需2 mg(干質量)喜樹材料即可實現對喜樹堿含量的提取和測定，相對于現有基于HPLC—紫外檢測的喜樹堿含量測定方法大大減小了測定樣品需要量。

相對于紫外檢測器而言，熒光檢測具有更高的靈敏度，因此適用于微量物質的檢測。HPLC—熒光檢測器測定喜樹堿含量的方法，已用于動物血漿中各種喜樹堿衍生物的含量測定［6－8］;但對于以喜樹植物材料為樣品的喜樹堿含量測定，目前還沒有文獻報道。在對叢枝菌根真菌與喜樹幼苗共生關系的研究中，需要對喜樹幼苗不同級別細根中的喜樹堿進行精細分析，測定微小根段中的喜樹堿含量，采用HPLC—熒光檢測法代替傳統的紫外檢測法成為解決問題的關鍵。以2 mg干質量的植物樣品用于喜樹堿的提取和含量測定，可以滿足對一株喜樹幼苗不同根段、不同組織部位的微量樣品進行喜樹堿含量測定的需求。這對今后進一步研究叢枝菌根對喜樹幼苗生長發育情況的影響以及喜樹中喜樹堿的合成及代謝機制提供了更精準可靠的方法。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al.Plant antitumor agentsⅠ:The isolation and structure of camptothecin a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor fromCamptotheca acuminate［J］.Journal of the American Chemical Society，1966，88:3888－3890.

［2］趙昕，閻秀峰.叢枝菌根對喜樹幼苗生長和氮、磷吸收的影響［J］.植物生態學報，2006，30(6):947－953.

［3］張麗艷，楊玉琴.反相高效液相色譜法測定喜樹果實中喜樹堿的含量［J］.中國中藥雜志，1997，22(4):234－235.

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［5］閻秀峰，王洋，于濤，等.喜樹葉中喜樹堿含量的高效液相色譜分析［J］.分析測試學報，2002，21(2):15－17.

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