響應面法優(yōu)化超聲波提取山核桃殼色素工藝

孫海濤 邵信儒

(通化師范學院，通化，134000)

色素是現(xiàn)代食品工業(yè)不可缺少的食品添加劑之一。目前所用的色素多為人工合成色素，雖然色澤鮮艷、著色性好、穩(wěn)定性好，但本身無任何營養(yǎng)價值，有的甚至有潛在的致癌作用或其他毒副作用，因此合成色素的安全問題越來越受人們關注［1-2］。天然色素不僅安全性高，使食品顏色更接近新鮮食品自然的色澤，而且有些色素還具有營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用［3］。隨著人們崇尚天然、追求健康的意識增強，開發(fā)天然色素將成為必然趨勢。

長白山野生山核桃，又稱小胡桃，生長在氣候優(yōu)越、土壤肥沃、植被茂盛的長白山區(qū)，每年白露前后成熟。其果仁是一種健康味美、營養(yǎng)豐富的天然綠色食品，具有潤沛強腎、降低血脂、預防冠心病之功效，長期食用具有益壽養(yǎng)顏，抗衰老等作用，孕婦食用對胎兒智力發(fā)育有神奇功效。目前關于其殼的研究較少，常因其堅硬且不可食用而為燃料，利用價值極低。國外的研究者主要利用核桃殼制備顆粒活性炭和分子篩［4-5］。若能利用長白山野生山核桃殼提取棕色素，應用于食品加工，可有效提高長白山野生山核桃的附加值。本研究在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優(yōu)化超聲波提取山核桃殼色素工藝，為長白山野生山核桃殼色素的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山核桃：2010年9月采摘于長白山區(qū);95%乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉，均為分析純。

TV-1901紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);YS-08型小型高速粉碎機(北京燕山正德機械設備有限公司);TDL80-2B離心機(上海安亭科學儀器廠);FA1604A型電子分析天平(上海精天電子儀器有限公司);DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 山核桃殼色素吸收光譜

配制一定體積分數(shù)的山核桃殼色素溶液，在250～500 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，測定色素的吸收光譜。由圖1可看出，山核桃殼色素溶液的吸收光譜在λ=277 nm處有明顯吸收峰。因此，可選取λmax=277 nm作為測定山核桃殼色素溶液吸光度的特定波長。

圖1 山核桃殼色素提取液的吸收光譜

1.2.2 山核桃殼色素的提取

工藝要點：將已篩選好的山核桃殼清洗干凈，烘干，放入高速粉碎機中粉碎，過50目篩，備用。稱取一定量的山核桃殼粉末，加入適量的提取劑。按要求在超聲波輔助作用下提取，提取液定容至一定刻度，靜置過濾，濾液離心(4 000 r/min，10 min)，在277 nm波長處測定吸光度［6］。

1.2.3 單因素試驗

本試驗中選擇液料比、乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲溫度、超聲時間作為影響山核桃殼色素提取效果的單因素，在各因素試驗中采用如1.2.2所述的方法進行色素的提取，以色素提取液吸光度的變化作為評價指標。

液料比對色素提取效果的影響：在乙醇體積分數(shù)為50%，超聲功率160 w，超聲溫度50℃，超聲時間60 min，研究液料比分別為5 mL∶1 g、10 mL∶1 g、15 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、25 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、35 mL∶1 g時對山核桃殼色素提取效果的影響。

乙醇體積分數(shù)對色素提取效果的影響：在液料比15 mL∶1 g，超聲功率160 W，超聲溫度50℃，超聲時間60 min，研究乙醇體積分數(shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95% 時對山核桃殼色素提取效果的影響。

超聲功率對色素提取效果的影響：在液料比15 mL∶1 g，乙醇體積分數(shù)為50%，超聲溫度50℃，超聲時間60 min，研究超聲功率分別為 80、100、120、140、160、180、200 W時對山核桃殼色素提取效果的影響。

超聲溫度對色素提取效果的影響：在液料比15 mL∶1 g，乙醇體積分數(shù)為50%，超聲功率160 W，超聲時間60 min，研究超聲溫度分別為 30、40、50、60、70、80℃時對山核桃殼色素提取效果的影響。

超聲時間對色素提取效果的影響：在液料比15 mL∶1 g，乙醇體積分數(shù)為50%，超聲溫度50℃，超聲功率160 W，研究超聲時間分別為20、40、60、80、100、120時對山核桃殼色素提取效果的影響。

1.2.4 響應曲面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取液料比、乙醇體積分數(shù)、超聲功率為自變量，山核桃殼色素的吸光度為響應值，通過Design Expert 7.1.3軟件設計3因素3水平的二次回歸分析，預測山核桃殼色素提取的最佳工藝［7］。響應面分析因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對提取效果的影響

液料比是提取過程的一個重要影響因素，從傳質(zhì)速率的角度講，主要表現(xiàn)在影響固相主體和液相主體之間的濃度差，即傳質(zhì)推動力。經(jīng)測定，在乙醇體積分數(shù)、超聲功率、超聲溫度、超聲時間不變條件下，隨著液料比的增加，提取液的吸光度逐漸增大;當液料比達到15mL∶1g時，提取液的吸光度為0.649，此時達到最大值;但當液料比超過15 mL∶1 g時，隨著液料比的增大，色素的吸光度不斷下降。故本研究把液料比10 mL∶1 g～20 mL∶1 g作為響應面法的考查范圍。

2.1.2 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響

經(jīng)實驗得知，在液料比、超聲功率、超聲溫度、超聲時間不變的條件下，乙醇體積分數(shù)在10%～50%的范圍內(nèi)，山核桃殼色素吸光度隨著乙醇體積分數(shù)的增大不斷增大，在乙醇體積分數(shù)為50%時提取液吸光度達到最大值0.644;當乙醇體積分數(shù)超過50%時，山核桃殼色素的吸光度逐漸下降;而當乙醇體積分數(shù)超過80%時，吸光度急劇下降。其原因可能是由于乙醇體積分數(shù)過大，造成色素分解。故把乙醇體積分數(shù)40%～60%作為響應面法的考查范圍。

2.1.3 超聲功率對色素提取效果的影響

在液料比、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、超聲時間不變的條件下，超聲功率在80～120 W范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增大，提取液的吸光度明顯上升;當超聲功率在120～160 W時，吸光度變化趨勢不明顯，且在超聲功率為140 W時，提取液吸光度達到最大值0.698;當超聲功率達到180 W以上時，提取液的吸光度下降。這可能是由于超聲功率過高，超聲波的熱效應導致提取溶液溫度升高，造成色素不穩(wěn)定而分解。故本研究把超聲功率120～160 W作為響應面法的考查范圍。

2.1.4 超聲溫度對色素提取效果的影響

經(jīng)測定，在液料比、乙醇體積分數(shù)為、超聲功率、超聲時間不變的條件下，隨超聲溫度的升高，山核桃殼色素吸光值呈逐漸升高的趨勢，并在超聲溫度為60℃時，提取液吸光度值達到最大值0.636，此時山核桃殼色素溶出最多。這說明在超聲條件下，在較低溫度下即可達到色素最大溶出量，提取溫度過高可能使色素結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。故本研究確定超聲溫度為60℃。

2.1.5 超聲時間對色素提取效果的影響

在液料比、乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、超聲功率不變的條件下，當超聲時間不超過60 min時，隨著時間的延長，山核桃殼色素吸光度呈明顯增大的趨勢;但在超聲時間為60～80 min范圍內(nèi)時，提取液的吸光度值變化不明顯;當超聲時間達到80 min后，如繼續(xù)延長超聲時間，提取液吸光度明顯下降。這可能是由于超聲時間過長，色素遭到破壞，同時考慮工作效率等因素，不宜長時間超聲提取。故本研究確定超聲提取時間為60 min。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗

根據(jù)Box Benhnken的中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗影響結(jié)果，選擇液料比(X1)、乙醇體積分數(shù)(X2)和超聲功率(X3)3個因素，進行3因素3水平響應面分析試驗。利用Design Expert 7.1.3軟件對響應面試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到山核桃殼色素吸光度與自變量X1、X2和X3的二次回歸方程：Y=0.79+0.022X1+2.750×10-3X2+0.023X3-1.500×10-3X1X2+0.026X1X3-0.010X2X3-0.053-0.045-0.028X。

方差分析及顯著性檢驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該回歸模型極顯著(P=0.003 1＜0.01)，回歸模型的決定系數(shù)為 R2=0.927 5，失擬項 P=0.064＞0.05，失擬性檢驗結(jié)果不顯著。這說明該模型與數(shù)據(jù)擬合程度較高，實驗誤差小，可以用該模型分析和預測超聲法輔助提取山核桃殼色素的結(jié)果。此外，回歸方程各項的方差分析結(jié)果還表明，各因素中二次項對色素提取效果的影響極顯著，一次項X1、X3和交互項X1X3對色素提取效果的影響顯著。

表2 回歸方程方差分析

2.2.2 響應面分析

當超聲時間為60 min時，液料比和乙醇體積分數(shù)對山核桃殼色素提取效果的影響見圖2。可以看出，當液料比不變時，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，山核桃殼色素吸光度先增大，當乙醇體積分數(shù)達到一定值后，呈逐漸下降的趨勢。當乙醇體積分數(shù)在45%～55%范圍內(nèi)，液料比在10 mL∶1 g～20 mL∶1 g范圍內(nèi)，山核桃殼提取液的吸光度達到最大值。

圖2 液料比和乙醇體積分數(shù)對吸光度影響的相應面圖和等高線圖

當乙醇體積分數(shù)為50%，液料比和超聲功率對山核桃殼色素提取效果的影響見圖3。可以看出，液料比和超聲功率對色素吸光度的交互作用顯著。當液料比不變，隨著超聲功率的提高，山核桃殼色素的吸光度逐漸增大;當超聲功率達到一定值后，山核桃殼色素吸光度逐漸下降。當超聲功率恒定，液料比在10 mL∶1 g～20 mL∶1 g范圍內(nèi)，山核桃殼色素吸光度先逐漸增大，達到極值后顯著下降。

當超聲功率為140 W，乙醇體積分數(shù)和超聲功率對山核桃殼色素提取效果的影響見圖4。可以看出，當超聲功率不變，隨著乙醇體積分數(shù)的提高，山核桃殼色素吸光度值先增大;當乙醇體積分數(shù)達到一定值后，山核桃殼色素吸光度值呈逐漸下降的趨勢。當乙醇體積分數(shù)恒定在40%～50%范圍內(nèi)，超聲功率在120～160 W范圍內(nèi)，山核桃殼色素提取液吸光度值隨著超聲功率的提高而增大，并達到最大值。同時說明，二者的交互作用中超聲功率相對于乙醇體積分數(shù)而言居于主要方面。

由 Design-Expert7.1.3 Trial軟件分析出超聲波輔助提取山核桃殼色素的最佳條件：液料比16.74mL ∶1 g、乙醇體積分數(shù) 49.57%、超聲功率 151.54 W，山核桃殼色素吸光度的預測值為0.801。為了進一步驗證山核桃殼色素最優(yōu)的超聲波輔助提取工藝，考慮到實際操作的情況，將最佳工藝條件修正為液料比17 mL∶1 g、乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率152 W。采用上述條件進行了3次重復試驗，得出色素的平均吸光度為0.799，與理論預測值誤差僅為0.3%，驗證結(jié)果與預測值偏差較小，說明采用響應面法得到的工藝參數(shù)是可行的。

圖3 液料比和超聲功率對吸光度影響的相應面圖和等高線圖

圖4 乙醇體積分數(shù)和超聲功率對吸光度影響的相應面圖和等高線圖

2.3 超聲輔助法與常規(guī)水浴法提取山核桃殼色素的比較

對上述已確定的超聲波輔助提取山核桃殼色素最佳提取條件與常規(guī)水浴提取山核桃殼色素最佳提取條件(液料比20 mL∶1 g、乙醇體積分數(shù)50%、提取溫度70℃、提取時間120 min)進行比較，同時對各自提取效果進行對比。試驗結(jié)果表明，常規(guī)水浴法提取山核桃殼色素得到的提取液的吸光度平均為0.575，超聲波輔助提取得到的色素提取液平均吸光度為0.799。所以，超聲輔助法更有利于細胞中的有效成分快速釋放溶出，可以提高山核桃殼色素的提取效果，同時可大大縮短提取時間。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優(yōu)化超聲輔助提取山核桃殼色素的提取工藝，建立了超聲波輔助提取山核桃殼色素多元回歸模型，模型擬合度良好。確定了山核桃殼色素的最佳提取條件：V(溶液)∶m(山核桃殼)=17 mL∶1 g、乙醇體積分數(shù)50%、超聲功率152 W，山核桃殼色素吸光度的預測值為0.801，通過優(yōu)化方案的驗證實驗得出色素的吸光度為0.799。

用常規(guī)水浴法提取山核桃殼色素吸光度為0.575，與其相比超聲輔助提取法更為有效。其原因在于超聲的熱效應使局部升溫，促進了色素的溶出;另外超聲波空化時產(chǎn)生極大壓力，有利于提高組織細胞壁的通透性，使色素更易被提取。至于更深入的超聲波對山核桃殼色素結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等的影響有待進一步研究。

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