何首烏、骨碎補和淫羊藿的植物雌激素作用研究

楊利娟，黃君梅，王飛

雌激素是人體內一種重要的內源性物質, 在生殖、免疫、骨骼、心血管和中樞神經系統中發揮重要作用，在臨床上廣泛應用于預防和治療絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP)。但是長期應用會導致乳腺癌和子宮內膜癌發病率上升等副作用[1]。因此，迫切需要尋求具有雌激素作用，但臨床副作用更小，更為安全的藥物。本研究在充分認識骨質疏松癥發病機理的基礎上，以中醫“腎主骨”理論為指導，選取補腎中藥何首烏Polygonum multiflorumThunb、骨碎補Drynaria fartunei(Kunze)J.Sm.和淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.為研究對象，擬分別評價何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物及其主要成分對雌激素受體ERα和ERβ的選擇性激動作用，為其臨床應用于骨質疏松作用機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品

何首烏(70%乙醇提取)、骨碎補（50%乙醇提取）、淫羊藿（水提取）浸膏由河北以嶺制藥廠提供，大黃素、大黃酸、大黃酚、二苯乙烯苷、淫羊藿苷、柚皮苷（純度99%以上）均購自中國藥品生物制品檢定所。藥品用DMSO溶解備用。

1.2 試劑與儀器

DMEM高糖培養液、新生小牛血清、活性炭處理去內源激素新生小牛血清、10%青鏈霉素液、胰酶購自成都哈里生物有限公司。DMSO購自美國Amresco公司。OPTI-MEM?I培養液購自GIBCO。17 β-Estradiol (E2)購自Sigma公司。轉染試劑Liprfectamine2000購自Invitrogen公司。XDS-1B型倒置相差顯微鏡（COIC）；二氧化碳培養箱（美國Thermo）；Varioskan F型全波長掃描式多功能讀數儀（美國Thermo）。

1.3 細胞培養

宮頸癌細胞（HeLa細胞）培養于含10%新生小牛血清、1%雙抗（青霉素，鏈霉素）的DMEM高糖培養基中，置于培養箱中孵育，每周傳代一次。

1.4 質粒

pCIneo-hERα質粒、pIRES-hERβ質粒、pGL3-5×ERE-Luc報告質粒由本實驗室自行構建，pSV-βgal內參質粒購自promega公司。

1.5 轉染

用含10%活性炭處理去內源激素新生小牛血清無抗生素的DMEM培養液將HeLa細胞接種于24孔板中，待細胞密度達到70%～90%時，按Lipofectamin2000操作步驟把0.4 μg pCIneo-hERα質粒或pIRES-hERβ、0.2 μg pGL3-5×ERE-Luc報告質粒、0.2 μg pSV-β-gal共轉染進HeLa細胞中，6 h后換成新鮮含10%活性炭處理去內源激素新生小牛血清無抗生素的DMEM培養液。24 h后對照組（DMSO）和不同濃度藥物組加入相應的孔中誘導報告基因Luc的表達。24 h后棄去細胞培養液，用PBS洗三次，每孔加入細胞裂解液200 μL。充分裂解細胞后，于4000 g離心2 min，并將上清液轉入干凈EP管，混勻后取50 μL加入熒光素酶底物檢測熒光素酶的活性，另取100 μL加入β-gal的反應底物ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），于37 ℃孵育反應30 min后，加入Na2CO3(1 mol.L-1)終止反應，各吸取200 μL加入96孔板中用酶標儀檢測420 nm波長吸光度值；通過標準曲線計算β-gal的濃度對轉染效率進行校正。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0統計軟件處理實驗數據，所得數據以x±SD表示，多組比較采用單因素方差分析進行比較， P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物對ERα 和 ERβ的選擇性激動作用

為了排除何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物對ERE報告基因的影響，用不同濃度的中藥粗提物處理瞬時轉染pGL3-5×ERE-Luc 的HeLa細胞。結果顯示，與對照組（DMSO處理）相比，不同濃度的中藥粗提物對ERE報告基因的轉錄并無影響（見表1）。為了研究何首烏、骨碎補和淫羊藿粗提物對ERα 和 ERβ的選擇性激動作用，將ERα或ERβ分別與pGL3-5×ERE-Luc共轉染HeLa細胞后，加入不同濃度的中藥提取物。結果顯示，與對照組相比，各中藥提取物均可誘導ERE報告基因轉錄激活，并且骨碎補(100 μg.mL-1)和淫羊藿(100 μg.mL-1)對過表達ERβ的HeLa細胞作用更明顯，說明這兩種中藥提取物對ERβ的選擇性更高。

表1 三種中藥粗提物對ERE報告基因的轉錄激活作用

2.2 幾種中藥中主要單體分對ERα和ERβ的選擇性激動作用

為了排除何首烏、骨碎補和淫羊藿主要單體成分對ERE報告基因的影響，用不同濃度的單體化合物處理瞬時轉染pGL3-5×ERE-Luc 的HeLa細胞。結果顯示，與對照組（DMSO處理）相比，不同濃度的單體化合物對ERE報告基因的轉錄并無影響（見表2）。為了研究何首烏、骨碎補和淫羊藿主要單體成分對ERα 和 ERβ的選擇性激動作用，將ERα或ERβ分別與pGL3-5×ERE-Luc共轉染HeLa細胞后，加入不同濃度的單體化合物。結果如表2所示，與對照組比較，發現何首烏的主要成分大黃素、骨碎補的主要成分柚皮苷和淫羊藿的主要成分淫羊藿苷能顯著誘導ERE報告基因轉錄激活，并且對過表達ERβ的HeLa細胞作用更明顯。

表2 三種中藥主要單體成分對ERE報告基因的轉錄激活作用

3 討論

由于目前臨床上治療骨質疏松癥主要應用的是化學合成藥物，這些化學合成藥物均存在一定的副作用，利用天然中草藥及其制劑治療該病已成為醫藥界研究的熱點。在用于治療骨質疏松的中藥中，補腎中藥淫羊藿、骨碎補和何首烏在臨床上應用較廣, 但其作用機制尚不明確。研究已經證實，雌激素在骨代謝平衡中起重要的調節作用,它可直接抑制造血干細胞和單核細胞產生刺激破骨細胞前增殖的細胞因子而且能直接抑制成熟破骨細胞分化, 促進破骨細胞的凋亡從而抑制骨吸收[11]。鑒于這些理論基礎，我們研究何首烏、骨碎補和淫羊藿抗骨質疏松中藥中的植物雌激素作用物質成分，從而為這三種中藥臨床應用于骨質疏松作用機制研究提供重要的理論依據。

雌激素的經典作用機制認為 ,雌激素首先與激素受體上的配體結合區（ligand binding domain,LBD）結合使得受體分子形成二聚體 ,從而使得ER的DNA結合區(DNA binding domain,DBD)與基因啟動上的雌激素反應元件結合，啟動基因轉錄。研究表明，ERα和ERβ與雌激素或選擇性雌激素調節劑結合后，能激活不同基因的轉錄，這可能就是在成骨細胞和破骨細胞中，ERα和ERβ發揮不同作用來治療骨質疏松癥的原因[12]。Cvoro等人發現，ERβ受體的選擇性激活作用能抑制乳腺癌細胞的增殖，這樣選擇性結合ERβ受體的植物雌激素更加有助于減少治療骨質疏松的副作用[13]。

本研究中，首先在缺乏ER的HeLa細胞中分別加入何首烏、淫羊藿和骨碎補這三種中藥的粗提物，結果表明這三種中藥的粗提物對ERE報告基因并沒有轉錄調節作用，而在過表達ERα或ERβ的HeLa細胞中，各中藥提取物均可誘導ERE報告基因轉錄激活，說明何首烏、骨碎補和淫羊藿中具有植物雌激素作用的物質成分。為了進一步證實這三種中藥中植物雌激素的主要物質成分是哪幾種化合物，我們按照同樣的方法分別考察了何首烏、骨碎補和淫羊藿中的主要活性物質，結果顯示何首烏主要活性成分大黃素、骨碎補中的柚皮苷和淫羊藿中的淫羊藿苷均能顯著產生植物雌激素作用。其中，淫羊藿苷對ERβ的作用更強，表明對ERβ的選擇性可能是這些中藥在臨床上具有治療骨質疏松作用，但是副作用較小的原因之一。對何首烏、骨碎補和淫羊藿治療骨質疏松的作用機制上具有重要的參考價值。

[1] Scheibor MD, Rebar RW.Isof l avones and postmenopausabone health:A Viable Alternative to Estrogen Therapy?[J].Menopause,1999,6(3):233.

[2] 羅瑞芝,賈偉,趙利斌,等.何首烏研究進展[J].中草藥,2005,36(7):7901.

[3] 朱鐵英.何首烏化學成分研究進展[J].時珍國醫國藥,2006,17(2):172.

[4] 高穎,房德敏.骨碎補黃酮類化合物的研究進展與開發前景[J].中草藥,2009,40(2):323.

[5] Matsuda H,Shimoda H,Morikawa T,et al.Phytoestrogen from the roots of polygonum cuspidatum( Polygonaceae):structure-Requirement of hydroxyanthraquinones for estrogenic activity[J].Bioorg Med Chem Lett ,2001 ,11 :1839.

[6] Usui T, Ikeda Y, Tagami T, et al.The phytochemical lindleyin.islolated from Rhei rhizoma , mediates hormonal effects through estrogen receptors[J].Endocrinol ,2002 ,175 :289.

[7] 史鳳芹,于世鳳,張潤荃,等.大黃對破骨細胞性骨吸收作用的研究[J].現代口腔醫學雜志,1995 ,9 :193.

[8] 鄒麗宜,吳鐵.何首烏防治骨質疏松癥的研究進展[J].現代醫藥衛生,2011,27(22):3418.

[9] 于燕,顏虹,胡森科.淫羊藿提取物的雌激素樣作用研究[J].西安交通大學學報(醫學版),2009,30(3):373.

[10] Chang E J, Lee W J, Ch o S H, et al.Proliferative effects of fl avan-3-ols and propelargonidins from rhizomes of Drynaria fortunei on MCF -7 and osteoblastic cells [J].Arch Pharm Res, 2003, 26( 8) : 620.

[11] SudaT,UdagawaN,NakamuraI,et al.Modulation of osteoclast differentiation by local factors[J].Bone,1995 , 17 ( 2 Supp l):87S.

[12] Tee, M.K., Rogatsky, I., Tzagarakis-Foster, et al.Estradiol and selective estrogen receptor modulators differentially regulate target genes with estrogen receptors α and β[J].Molecular Biology of the Cell ,2004,15:1262.

[13] Cvoro, A., Paruthiyil, S., Jones, J.O., et al.Selective activation of estrogen receptor-β transcriptional pathways by an herbal extract[J].Endocrinology,2007,148: 538.