4mm和6mm做為直徑90mm平皿中水解酪蛋白瓊脂的厚度的對比分析

李醫 原霞 王寶銀

抗菌藥物敏感性試驗是一種用于考察藥物抗菌活性的體外實驗，一般被用于抗菌藥物的初期篩選及對抗菌藥物的臨床療效進行預測。由于抗菌藥物敏感性試驗的實驗結果將直接影響到臨床使用抗菌藥物的初期篩選，因此保證抗菌藥物敏感性試驗的準確合理十分重要［1］。細菌對抗生素的敏感試驗有多種方法，大多數實驗室采用傳統的瓊脂擴散法，即K-B法。所使用的培養基是以水解酪蛋白為主要成分的M-H培養基。影響藥敏試驗的因素也很多，如培養基的配制量、細菌接種量、藥敏紙片的質量、紙片含藥的準確性和均勻性等，這其中培養基的配制量又是重中之重，有研究證明，平板每增厚或減薄1 mm抑菌圈相應減少或增大0.7mm。然而在包括操作規程在內的所有資料中顯示“水解酪蛋白傾制平板，瓊脂平板厚度為4mm±1mm”。經過反復測試后，得出了4mm瓊脂厚度只相當于在直徑90mm平皿中加入了17毫升的培養基。但是在水解酪蛋白瓊脂粉的配制說明中卻提到“用吸管吸取25ml培養基傾注直徑90mm滅菌平皿中”。對25ml水解酪蛋白制成的培養皿進行反復測量后，得出了其厚度相當于6mm。這兩種說法之間出現了偏差，它們之間相差了2mm、8ml之多。那么到底是用4mm厚度做為直徑90mm滅菌平皿中M-H培養基的傾注厚度，還是用6mm厚度做為直徑90mm滅菌平皿中M-H培養基的傾注厚度呢?鑒于上述問題，本文在同一條件下分別以4mm傾注厚度和6mm傾注厚度做為兩個不同測量單位，對四種質控菌株進行了30次試驗，測量其抑菌圈的直徑并把測量的結果與“4種非苛養菌質控菌株對部分抗菌藥物的抑菌環允許范圍”進行對比，力圖為K-B法手工配置的M-H培養基的傾注厚度提供較為準確的依據和參考。

儀器與材料

一、材料和試劑

1.架盤天平(浙江省慈溪市天東衡器廠);壓力蒸汽滅菌器(山東威高集團醫用高分子制品有限公司);90mm培養皿和30ml注射器(江蘇康健醫療用品有限公司);比濁儀和0.85%NaCl(法國梅里埃公司);水解酪蛋白瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司);配置用水(武漢江漢醫療制藥有限公司生產的水處理裝置制備的純凈水);藥敏紙片(英國Oxoid公司);藥敏判讀按照美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI)2009年版的標準判讀。

2.質控菌株 ATCC25922大腸埃希氏菌;ATCC25923金黃色葡萄球菌;ATCC35218含酶大腸埃希菌;ATCC27853銅綠假單胞菌;均購自衛生部臨檢中心.

3.質控菌株的保存 每次從血平板上挑取菌落接種于營養肉湯后裝成10支小瓶放于-20℃保存，每周一取1支轉種于血平皿上，周二再傳代1次，周三進行藥敏試驗。用到最后1支時繼續前面的操作。

二、方法

1.采用K-B法分別用瓊脂厚度為4mm和瓊脂厚度為6mm的M-H培養基監測四種非苛養菌質控菌株對抗菌藥物的抑菌環直徑并與質控菌株的抑菌環允許范圍進行比較。具體藥名見表1。

2.培養基的制備 按要求稱取一定量水解酪蛋白瓊脂，加入純凈水，待完全溶解后放到電子萬用爐上加熱，然后放入高壓蒸汽滅菌器內，121℃15分鐘高壓，高壓后取出并放入已消毒好的超凈工作臺內，待自然冷卻至50℃左右，將其倒入同時進行高壓的無菌缸內，用30ml注射器吸取17ml和25ml分別放入無菌平皿中(在使用新注射器時先做一個“吸入-棄去”的動作)，制成M-H培養基備用。每周配制一次。

3.制備菌液 菌液濃度調至0.5麥氏比濁標準。

4.接種平板用新的無菌棉簽蘸取調好的菌液，在液面上方管壁處旋轉擠壓幾次，擠掉過多的菌液。再用棉簽在無菌的稍干燥的M-H培養基表面涂布，每次將平皿旋轉60度，反復涂布6次，最后用棉簽涂抹瓊脂的邊緣。每根棉簽最多涂抹2個平皿。待培養皿吸收3～5分鐘的水分后，開始貼藥敏紙片。

5.貼藥敏紙片 藥敏紙片已事先從冰箱中取出并恢復了室溫，將抗菌藥物紙片貼于接種好的瓊脂平板表面。貼一個紙片用鑷子壓一下，并經火焰滅菌鑷子尖。每個平板貼5個紙片［2］。貼完紙片后，在室溫放置了10分鐘，并將平板倒過來，置于35℃溫箱中。

6.讀取結果 孵育18～24h后，觀察結果。菌液濃度合適且涂布好，抑菌圈為正圓形，菌落呈融合生長。在黑色不反光的背景將直尺置于反轉的平板背面量取抑菌環直徑，單位為毫米。三、統計學分析

應用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，計數資料的組間比較采用χ2檢驗，P值＜0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1.在ATCC25922大腸埃希菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有氨芐西林/舒巴坦、左旋氧氟沙星、頭孢呋辛、美羅培南、呋喃妥因、復方新諾明、頭孢哌酮/舒巴坦，而具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有氨芐西林、頭孢噻肟。

2.在ATCC25923金黃色葡萄球菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有左旋氧氟沙星、呋喃妥因、苯唑西林，頭孢西丁，而具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有青霉素、磷霉素。

3.在ATCC27853銅綠假單胞菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有環丙沙星、左旋氧氟沙星、頭孢他啶，具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有氨曲南、頭孢吡肟。

4.在ATCC35218含酶大腸埃希菌中，具有非常顯著性意義(P值＜0.01)的藥物有氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦，而具有顯著性意義(P＜0.05)的藥物有阿莫西林/克拉維酸。

5.結果分析從表2-表5中可以看出:P值＜0.01的藥物有10種，說明用17ml做為M-H培養基中水解酪蛋白的灌注量對這10種藥物的結果具有非常顯著的影響。P值＜0.05的藥物有7種，說明用17ml做為M-H培養基中水解酪蛋白的灌注量對這7種藥物的結果具有顯著的影響。而其中氨芐西林/舒巴坦、左旋氧氟沙星、呋喃妥因這3種藥物出現的頻率最多，其結果受到的影響也最為明顯，說明這3種藥物所受到的影響具有普遍性。

表2 ATCC25922大腸埃希菌

表3 ATCC25923金黃色葡萄球菌

表4 ATCC27853銅綠假單胞菌

表5 ATCC35218含酶大腸埃希菌

討 論

臨床微生物實驗室的一項重要內容是對病源微生物進行藥敏試驗，測定其對抗菌藥物的敏感程度，這對臨床醫師合理選用抗生素，有效控制感染，避免濫用抗生素防止耐藥株的出現，具有重要意義。

然而藥敏試驗中整個過程的關鍵點就是藥敏培養基的質量，前面也提到平板每增厚或減薄1 mm抑菌圈相應減少或增大0.7 mm［3］。而在本次試驗中所得到的數據為M-H培養基的量每增加4 ml抑菌圈的直徑增大0.9335 mm，與上述的數據相近。這說明在日常工作中藥敏結果會受到M-H培養基中水解酪蛋白的量的影響。培養基的配制量應該是保證一切藥敏結果質量的源頭，如果其準確度從源頭上就遭到質疑那對以后的結果將起到影響。

1 李薇，宋新波，習利平.藥物敏感性試驗中不同方法靈敏度的比較及助溶劑的篩選［J］.時珍國醫國藥，2010，21(8):2062.

2 Andrews JM.For the BSAC working party on susceptibility testing.BSAC standardized disc susceptibility testing method.J Antimicrob Chemother，2011，48(suppl)1:43-57.

3 張彩芳，張愛君.紙片擴散法藥敏試驗條件的選擇［J］.寧夏醫學雜志，2006，28(12):946-947.