萆苓方對糖尿病痛風模型大鼠內皮細胞及血糖血尿酸的影響

李中南，李莉，陳光亮，汪俊

(1.安徽中醫學院第一附屬醫院內分泌科，合肥 230031;2.安徽中醫學院藥理室)

隨著經濟的發展，人們生活水平的提高，糖尿病合并痛風發病率逐年增高，共同構成了心血管疾病的危險因素。有資料顯示，重度胰島素抵抗，胰島B細胞分泌功能障礙，明顯增加了糖代謝異常，是糖尿病合并痛風的主要代謝特征，而炎癥因子、內皮細胞損傷貫穿兩病的始終。過高的血尿酸可損害胰島素B細胞誘發糖尿病已成為事實。二病并存，互為關聯，互為影響，使得病情進展加速［1-2］。如何控制炎癥因子，減少內皮細胞的損傷，通過多種途徑，保護腎臟、血管，減少并發癥是我們研究的新課題。本實驗選擇了安徽省中醫院名老中醫王正雨治療痛風的經驗方萆苓方，通過對大鼠糖尿病痛風模型的作用，觀察中藥對模型大鼠內皮細胞的影響，分析萆苓方降糖降尿酸的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選擇健康清潔級雄性Wistar大鼠70只，四周齡，平均體質量(230±20)g。

1.1.2 藥品及試劑 萆苓祛痛方，由安徽中醫學院第一附屬醫院制劑中心提供;吲哚美辛，上海辛帕斯制藥有限公司，批號:090301;二甲雙胍，天津太平洋制藥有限公司，批號:100604;鏈脲佐菌素(STZ)，美國Sigma公司，批號:s013020100109544;尿酸，美國Sigma公司，批號:058k0722;檸檬酸、檸檬酸鈉(國產分析純試劑);大鼠ET-1試劑盒，美國sigma公司生產批號:BPE10326R;大鼠NO試劑盒，南京建成生物工程研究所批號:20101027。

1.2 實驗儀器 美國強生穩豪型微量血糖儀(One Touch Utra1)及配套血糖試紙;BS224S電子天平;LXJ2I型離心機(上海醫用分析儀器廠);Bio—Rad 550酶標儀(美國Bio.Rad公司;Thermo Labsystems WeLLwash 4MK2全自動洗板機。

1.3 實驗條件 室溫20～30℃，濕度55% ～65%，空調控制。

1.4 實驗方法

1.4.1 制備糖尿病大鼠模型［3-4］取大鼠70只，我院動物中心飼養，室內溫度保持在25℃左右，濕度在5O%左右。明暗周期12h，自由飲水和進食。適應性喂養1周后，測體質量，大鼠體質量在230 g左右。根據體質量分層后進行隨機分組:健康對照組10只，模型組10只，萆苓祛痛方大、中、小組各10只，吲哚美辛組10只，二甲雙胍組10只。造模前禁食12h(不禁水)測血糖1次。

新鮮配制pH4.5的檸檬酸緩沖液(用檸檬酸和檸檬酸三鈉按一定比例配制)，4～8℃ 冷藏保存。臨用前將鏈脲佐菌素(STZ)配制成2%濃度的溶液，模型組、藥物組按40 mg/kg，1 ml/100 g，單次腹腔注射此溶液1次，健康對照組折算出等量的檸檬酸緩沖液注射1次。

72 h后測大鼠空腹尾靜脈血。以空腹血糖≥13.8 mmol/L作為糖尿病成模的標準。觀察各組大鼠造模后進食、飲水量，大鼠精神狀態、形體、毛色。造模成功后根據分組給藥，連續灌胃9 d。

1.4.2 制備痛風關節炎模型［5］制備尿酸鈉結晶:194 ml蒸餾水加6 ml NaOH，煮沸加1 g尿酸，用稀鹽酸調pH7.2，攪拌冷卻，4℃冰箱保存24 h，去上清液，用濾紙將沉淀物水分吸干，放入干燥箱70℃烘2 h，取出，刮下粉末，放人研缽內研成細末，用孔徑250μm的金屬網篩，過篩，裝瓶備用。用時取250 mg尿酸鈉結晶加45 ml0.9%氯化鈉注射溶液，再加5 ml吐溫80，加熱攪拌配成50 g/L尿酸鈉溶液。

取大鼠70只，根據上述分組稱重編號，痛風模型前4 d，模型組每日灌胃等體積的0.9%氯化鈉注射溶液，其他動物根據人用量與動物實驗用量的換算公式，計算出每只大鼠每次給藥量，萆苓祛痛方大、中、小組大鼠分別按 8 g/kg、4 g/kg、2 g/kg，吲哚美辛組大鼠按 10 g/kg，二甲雙胍組大鼠按50 mg/kg，給藥劑量皆為1 ml/1 g/100 g灌胃給藥，每天1次，連續灌胃4 d。

第4天除正常組外，每只實驗鼠均選右踝關節外側后方為穿刺點，針口斜面朝前上方與脛骨成45°夾角穿入踝關節腔，以4號針頭向關節腔注入0.2 ml尿酸鈉溶液，以關節囊對側鼓起為注入標準，誘導痛風模型。模型成功后繼續灌胃5 d。末次給藥后2h處死大鼠，腹主動脈抽血5 ml，加入試管，3 000 r/min離心10 min，分離血清，測定血尿酸、血糖值以及ET-1、NO并進行組間差異性比較。

1.4.3 測定大鼠血糖、血尿酸、ET-1、NO 數值，由本院生化實驗室完成。

1.5 統計學處理 全部數據統計在SPSS13.0軟件上進行，組間比較用t檢驗。

2 結果

2.1 對大鼠血糖、血尿酸的影響 模型組、藥物組用藥前血糖均顯著高于正常組(P＜0.01)，提示糖尿病模型成功。與療前比較，萆苓方高、中、低組、二甲雙胍組均能顯著降低血糖，但萆苓方作用弱于二甲雙胍組。結果還顯示萆苓方各組均能顯著降低血尿酸，與模型組比較療效十分顯著(P＜0.01)，優于吲哚美辛組，見表1。

表1 各組大鼠血糖、血尿酸的比較()

表1 各組大鼠血糖、血尿酸的比較()

注:與模型組比較，a P ＜0.01，c P ＜0.05;與療前組比較，b P ＜0.05

組別 鼠數(只)療前空腹血糖(mmol/L)療后空腹血糖(mmol/L)血尿酸(μmol/L)10 5.50 ±1.46 5.80 ±1.68 38.33 ±14.84模型組 10 16.32 ±2.42 14.91 ±3.26 68.50 ±21.36萆苓方(高)10 17.27 ±2.03 10.10 ±1.13ab 44.12 ±14.64a萆苓方(中)10 16.32 ±2.29 11.37 ±1.85ab 51.14 ±18.90a萆苓方(低)10 16.83 ±1.79 12.73 ±2.17bc 47.12 ±20.44a二甲雙胍 10 17.62 ±2.52 9.28 ±2.28ab 60.11 ±8.60吲哚美辛 10 17.85 ±3.29 14.60 ±3.25 52.5 ±8.89正常組a

2.2 對大鼠ET-T、NO的影響 造模后大鼠血管內皮細胞嚴重受損，ET-1數值明顯升高，灌胃萆苓方后(高、中劑量組)，ET-1指標下降(P＜0.05)。二甲雙胍、吲哚美辛組數值仍升高。提示萆苓方對大鼠血管內皮細胞有良好的保護作用，萆苓方藥物劑量與療效具有相關性，高、中組療效較為突出。動物造模后一氧化氮水平降低，灌胃萆苓方后，高、中、低各組的NO明顯升高，與模型組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。表明萆苓方有提高一氧化氮水平的作用，但療效不及吲哚美辛組，見表2。

表2 各組大鼠ET-T、NO的比較()

表2 各組大鼠ET-T、NO的比較()

注:與模型組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與吲哚美辛組比較，c P ＜0.05，d P ＜0.01

組別 例數 ET-1(ng/L) NO(μmol/L)10 9.51 ±3.38 8.06 ±4.85模型組 10 11.09 ±3.67 4.71 ±2.49萆苓方(高) 10 9.14 ±2.63a 14.75 ±4.13bc萆苓方(中) 10 9.45 ±4.14a 10.05 ±3.5bd萆苓方(低) 10 12.62 ±3.07 10.12 ±2.48bd二甲雙胍 10 12.54 ±3.01 13.51 ±5.84b吲哚美辛 10 13.46 ±3.82 18.16 ±5.83正常組b

3 討論

糖尿病和痛風均為代謝性疾病，也是當今危害人們健康的常見內分泌疾病。糖尿病常伴有高血壓、高血脂、肥胖、高尿酸血癥等，而高尿酸血癥是痛風發作的重要生化基礎。肥胖、血脂紊亂、糖耐量受損、胰島素抵抗等代謝綜合征組成部分的同時出現，往往是2型糖尿病發生、發展的重要危險因素［6-7］。我們選擇了痹苓方治療糖尿病合并痛風，該方有60多年的臨床實踐，有一定的藥理藥效學實驗基礎［5，8］，以清熱瀉濁，解毒活血立法。方中土茯苓、萆解、澤瀉、苡仁利濕瀉濁;黃柏、蒼術、虎杖清熱燥濕解毒;威靈仙祛風濕、通經絡、止疼痛;當歸與牛膝、虎杖合用有活血定痛、利尿通淋之效。共奏瀉濁解毒，活血通絡之功。本次實驗重點觀察了萆苓方對模型大鼠內皮細胞的影響及對血糖、血尿酸的作用。

3.1 對血糖、血尿酸的影響 越來越多的研究支持2型糖尿病是一種慢性低度炎癥狀態的假說。有研究報道，2型糖尿病常伴有多種炎癥因子濃度的升高，炎癥標志物能夠預測2型糖尿病的發生。有人通過實驗證明了2型糖尿病患者CRP、IL-6等炎癥因子水平較健康對照組明顯升高，亦有實驗證明抗炎治療可明顯改善2型糖尿病患者糖代謝異常。英國前瞻性糖尿病研究證實，二甲雙胍可能有降低血漿CRP的水平，減少氧化應激，改善血管內皮功能的作用［9-11］。我們的實驗也證實了這一點。表1提示模型動物予萆苓方后，高中劑量組的空腹血糖較前明顯下降(P＜0.01)，但療效弱于雙胍組(P＜0.05)。證實萆苓方可能通過抑制炎癥滲出降低動物的血糖水平。結果還提示，動物灌胃萆苓方后，高、中、低組的血尿酸水平明顯下降，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。說明萆苓方降低血尿酸的療效確切。分析其作用機制，可能是通過抑制炎癥因子急時相反應，加速尿酸排泄而發揮作用的。

3.2 對內皮細胞(ET-1)的作用 ET是目前發現最強的內源性縮血管物質，具有收縮血管，促使血管平滑肌增殖的作用，其與NO是一對拮抗因子［12］。眾所周知炎癥引起內皮細胞結構和功能異常，可能會導致胰島素在組織細胞中的運轉障礙而促進胰島素抵抗的發生。高尿酸血癥易引起血管內皮損傷，導致或加重動脈粥樣硬化。本文結果顯示，動物模型組血漿ET-1水平明顯高于對照組，提示糖尿病痛風可造成血管內皮細胞功能障礙。結果還報告，血尿酸水平與ET活性存在正相關性，予萆苓方后，高、中劑量組的ET-1水平下降，證實本方對血管內皮細胞有保護作用，高、中劑量組較為明顯。其病理機制推測可能與下列因素相關:①尿酸鹽結晶作為致炎因子可以損傷血管內皮細胞，使內皮細胞合成和釋放ET-1增加，造成血漿中的ET活性增加。②研究還表明，尿酸在體外增加血小板聚集，而且尿酸鹽結晶可激活血小板，使血小板活性增加，活化的血小板釋放PAI-1增加，使血漿PAI-1活性進一步增高。③尿酸的產生與糖酵解有關，糖酵解由胰島素控制，在胰島素抵抗狀態下，糖酵解過程中的中間產物向5-磷酸核糖及磷酸核糖磷酸轉移，導致血尿酸生成隨之增多，而高胰島素血癥本身也可引起ET釋放增加，從而形成惡性循環［13］。

3.3 對一氧化氮的影響 一氧化氮 (NO)是具有舒張血管，松弛血管平滑肌和抑制內皮細胞增殖作用的物質，對糖尿病患者發病有明顯影響。NO水平高低在一定程度上反映了糖尿病血管損傷的程度，NO低的糖尿病患者合并高尿酸血癥的發病率及危險性都高。研究還發現一氧化氮可通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性而抑制尿酸水平。NO的基礎水平取決于內皮型一氧化氮和酶基因［14］。糖尿病合并痛風，可以促進血小板活化粘附，啟動血凝過程，促進血凝，并沉積于小動脈壁，損傷血管內皮細胞，降低內皮NO釋放，導致血管內皮細胞功能紊亂及血管平滑肌細胞增殖，加速血管病變和糖耐量異常的發生發展［15-16］。我們在研究中注意到模型后大鼠的NO水平顯著降低，予萆苓方后各組的NO明顯升高，表明痹苓方有提升一氧化氮水平，保護血管內皮細胞的作用。

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