成都地區鴨疫里默氏桿菌的分離與鑒定

李建臻，楊 苗，吳永勝，曹雨辰，許禎瑩，孫越鴻

（1.成都市農林科學院畜牧研究所，四川 成都 611134；2.四川省出入境檢驗檢疫局技術中心，四川 成都 610041）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 自2009年10月～2011年6月，從成都所轄雙流、大邑、邛崍、崇州、新津、金堂等6市（縣）不同的養殖場收集出現神經癥狀，以及有纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎及腦膜炎病變的病死鴨，取其腦、心血、肝臟作為病料，分離細菌待檢。

1.1.2 試劑 培養基:巧克力瓊脂平板、鮮血瓊脂平板均參照微生物學實驗教程（姚火春，2001）自制，麥康凱瓊脂培養基（MACC）與腸桿菌科細菌生化常規鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K、RNase酶、PCR反應緩沖體系，瓊脂糖，溴化乙錠，6×Glycerol DNA Loading Buffer，均為TaKaRa公司產品；其他化學試劑如氯仿、異丙醇、乙醇、NaCl等，均為國產分析純產品。

1.1.3 參考菌株 RA-JX陽性菌株（1型），抗RA的1型血清以及大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌，均由成都市農業職業科技學院動物傳染病研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 鴨疫里默氏桿菌（RA）的分離培養 對疑似RA的病鴨、死鴨進行逐一剖檢，詳細記錄其日齡和病理變化。分別無菌從病鴨、死鴨的腦、肝臟和心臟采樣劃線接種于兔鮮血瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基，將兔鮮血瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基一起置于37℃溫箱中培養24～48 h，觀察細菌的生長情況。挑取只在兔鮮血瓊脂培養基上生長而不在麥康凱瓊脂培養基上生長的圓形、稍突起、表面光滑、透明的菌落，用兔鮮血瓊脂培養基進行純培養。再將純培養物進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察細菌的形態和染色特性。

1.2.2 細菌生化試驗 用分離出的純培養物分別作生化試驗，置37℃恒溫箱中培養72 h，每天觀察并記錄結果一次。

1.2.3 PCR試驗 鴨疫里默氏桿菌的PCR鑒定:參照楊苗等的方法進行，細菌DNA模板提取采用熱裂解方法。以熱裂解方法提取的細菌DNA為模板，針對16SrRNA的特異基因序列設計合成引物（由大連寶生物工程公司合成），然后進行PCR擴增，引物擴增的目的帶片段大小為844bp左右，用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳（80V，40min）EB染色，紫外線下觀察、拍照，分析PCR擴增產物。

1.2.4 血清型鑒定 參照楊宗維等的方法采用玻片凝集法對分離菌株進行血清型鑒定。方法如下：取25μL滅菌生理鹽水于滅菌的EP管中，用滅菌接種環輕輕挑取菌株的純培養物移入EP管并充分搖勻，以調整至1×109CFU/mL濃度的懸液作為抗原；分別取25μL抗原與25μL抗血清在玻片上混合均勻，室溫靜置，3min內判定并記錄結果；如3min內出現顆粒狀凝集者，則記為陽性（+），不出現凝集者記為陰性（-）；同時將RA的血清I型參考菌株抗原設為陽性對照，以大腸桿菌、沙門氏桿菌、PBS液為陰性對照。

2 結果

2.1 分離株的菌體形態和菌落培養特征 將RA疑似分離株接種到兔鮮血瓊脂培養基上培養48h后，長出表面光滑、微突起、圓形、閃光透明、奶油狀、直徑為0.5～2.0mm的菌落，在麥康凱平板上不生長；分離菌株經革蘭氏染色證實為革蘭氏陰性無芽孢小桿菌，常單個存在，偶爾呈鏈狀排列。結果共得到此類細菌17株。

2.2 生化試驗結果 17株RA分離物均不能發酵糖，皆能液化明膠（+），17株BS-RA分離物對鳥氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶分解都表現為陽性，其余各項全為陰性，基本符合RA的特征（見表1）。

2.2 PCR試驗結果 17株RA分離菌株皆擴增出844bp的目的條帶，而作為對照的大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌參考菌株均為陰性，詳見圖1。

表1 RA分離菌株的生化反應結果 株、%

圖1 PCR方法對RA分離株的檢測結果

2.3 血清型鑒定結果 將經細菌學檢查、生化試驗、PCR鑒定為RA的17株細菌分別編號SL1、SL2、SL3（來自成都雙流），DY1、DY2、DY3（來自成都大邑），QL1、QL2、QL3、QL4、QL5 （來自邛崍），CZ1、CZ2、CZ3（來自崇州），XJ1、XJ2（來自新津），JT（來自金堂），結果顯示：10個分離菌株均與RA 1型陽性血清發生陽性反應（SL1、SL2、SL3、DY1、DY2、QL1、QL3、QL4、CZ2、XJ2），其余7株因條件限制，未作進一步鑒定。

3 結論與分析

3.1 從成都所轄雙流、大邑、邛崍、崇州、新津、金堂等6個縣（市）的20個養殖場共69羽RA疑似病例中分離得到了17株細菌，經過病料觸片染色、細菌分離培養、生化反應鑒定、PCR技術鑒定等診斷為鴨疫里默氏桿菌感染。其中PCR檢測技術的發展為快速診斷疾病提供了便利，試驗中RA菌樣擴增出了目的條帶，而大腸桿菌、巴氏桿菌菌樣均未擴增出條帶，說明該方法具有特異性。利用PCR技術進行診斷既能保證準確率，又節省了時間。

3.2 用血清1型RA參考菌株標準陽性血清對所有分離株進行玻片凝集試驗，結果10個分離菌株均與RA 1型陽性血清發生陽性反應，其余7株未定型。17株RA分離株中，有10株為血清1型，占總分離株的58.8%，表明成都地區鴨疫里默氏桿菌流行以血清1型為主，但至少存在兩種不同的血清型，這與大多數學者的研究結果相符。同時提示我們，該病有多種血清型混合流行，防治難度有所增加，尤其是用單一菌種疫苗防治該病頗有難度。

[1]楊 苗，程安春.基于鴨疫里默氏桿菌16SrRIVA PCR檢測方法的建立和應用 [J].四川農業大學學報，2007，25（3）：343-347.

[2]楊平東，黃 偉，李 鑫，等.廣東、四川省和重慶地區鴨傳染性漿膜炎流行病學調查 [J].畜牧市場，2010，（5）：21-22.

[3]楊宗維，韋 平，周 祥，等.南寧市商業肉鴨鴨疫里默氏桿菌病的調查研究[J].廣西農業生物科學，2006，25（3）：210-214.