緋寒櫻細胞懸浮培養(yǎng)技術研究

王莉

（南昌大學 科學技術學院，江西 南昌 330029）

1 引言

緋寒櫻（PrunuscampanulataMaxim.）為薔薇科李屬落葉小喬木，又名福建山櫻花，其樹形優(yōu)美，早春著花，花色呈粉紅至緋紅色，顏色鮮艷，滿樹繁花高雅脫俗，令人心曠神怡，是優(yōu)良的行道樹和風景林樹種。近年在福建、湖北、廣東等地示范栽培，深受消費者的歡迎。但由于收集種子困難和扦插繁殖技術不成熟［1］，各種規(guī)格的苗木生產(chǎn)供不應求。目前，緋寒櫻離體快繁技術已有少量報道［2，3］，但主要集中在叢生芽誘導和生根誘導的研究，國內(nèi)尚無緋寒櫻細胞懸浮培養(yǎng)研究的報導。本文采用緋寒櫻嫩枝為外植體材料，誘導出緋寒櫻愈傷組織，進一步建立起緋寒櫻細胞懸浮培養(yǎng)體系，為加快緋寒櫻組培技術奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 材料

供試材料為緋寒櫻野生樹的嫩枝［4］。

2.2 方法

2.2.1 無菌外植體的獲得接種材料為當年抽生側芽飽滿的幼嫩莖段，在自來水下沖洗0.5h，然后在超凈工作臺上用1g／L的HgCl2溶液消毒6min，無菌水沖洗5次，70%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗2遍，用滅菌濾紙將殘留于外植體表面的水分吸干。接著將外植體放入經(jīng)滅菌處理的瓶中，1%L汞水浸泡7min（為確保外植體得到全面徹底的滅菌，要將瓶子加以搖蕩），然后用無菌水沖洗5遍以上，備用。

2.2.2 愈傷組織的誘導

在無菌條件下，借助顯微鏡將外植體頂端剝開，切取長約0.8cm、帶生長點及葉原基的莖段，接種于1／2MS＋0.5 6－BA＋0.01NAAmg／L培養(yǎng)基上15d誘導出愈傷組織。于 MS＋1.0 6－BA＋0.5NAAmg／L培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，取繼續(xù)培養(yǎng)25d的愈傷組織。

2.2.3 櫻花細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

將分散性好、疏松的愈傷組織，接種在MS液體培養(yǎng)基中，每150mL的三角瓶中加入液體培養(yǎng)基40mL，為了研究幾種常用植物激素對櫻花細胞懸浮培養(yǎng)的影響，選取6－BA和NAA以及2，4－D等3種激素（因素），每個因素設3個水平進行激素的篩選（表1）。搖床轉速為120r／min，溫度25℃。每隔10d繼代1次，連續(xù)培養(yǎng)4～5代后逐漸形成穩(wěn)定的細胞系。每隔1d在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、分散程度并照相，進行細胞計數(shù)，以建立細胞數(shù)量生長曲線。

表1 懸浮培養(yǎng)激素濃度正交實驗

2.2.4 細胞懸浮生長曲線的測定

取0.5g懸浮培養(yǎng)物，接入新鮮液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，每隔1d取樣1次，共培養(yǎng)13d，連續(xù)做3次平行實驗。

2.2.5 懸浮細胞數(shù)目的測定

用血球計數(shù)板法對懸浮細胞計數(shù)，每個結果為4次平行實驗的平均值。細胞數(shù)按下面公式計算：1mL懸浮液中的總細胞數(shù)＝A／5×25×104×B（A為5個中方格總細胞數(shù)，B為稀釋倍數(shù)）［5］。

3 結果與分析

3.1 不同激素配比對細胞懸浮培養(yǎng)的影響

在植物細胞培養(yǎng)的過程中激素的種類及配比都會對植物細胞的生長、發(fā)育、繁殖、分化和新陳代謝起重要調(diào)節(jié)控制作用。因此本研究選用了不同激素配比來進行實驗，各種激素組合對懸浮培養(yǎng)物的生長狀態(tài)如圖1。

圖1 不同激素配比對懸浮培養(yǎng)細胞增重的影響

隨著生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的增高，懸浮細胞生長量加大，顏色為淡黃色或黃色。當生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度增至1.5mg／L 6－BA＋3.0mg／L NAA＋1.5mg／L2，4－D時，懸浮細胞生長受到了明顯的抑制，而且培養(yǎng)液渾濁。因此，生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合以1.0mg／L 6－BA＋2.0mg／L NAA＋1.0mg／L2，4－D為宜，此條件下細胞懸浮液為白色混濁，有許多大顆粒，細胞多數(shù)成團，保持較旺盛的分裂能力，見圖2。

圖2 生長狀態(tài)良好的懸浮培養(yǎng)物

3.2 不同起始密度對懸浮細胞生長的影響

培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)物密度過高過低都會阻礙培養(yǎng)物的繼代培養(yǎng)，即懸浮細胞的生長具有群聚效應，細胞密度太低，懸浮細胞生長緩慢；細胞密度過高時，細胞生長速度過快，細胞液泡變大，懸浮細胞容易積累有害物質(zhì)，不利于懸浮細胞系的建立。只有密度合適，才能促進細胞生長，利于培養(yǎng)物的分散，形成細微的細胞團顆粒，建成胚性細胞系效應［6］。因此應當添加適當?shù)呐囵B(yǎng)物于培養(yǎng)瓶內(nèi)，當發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)物密度過大時，應及時分裝進行繼代培養(yǎng)。同時還要及時淘汰一些大的組織塊和黃褐色的壞死組織。

表2所示的是不同起始密度對懸浮細胞生長的影響。結果表明：懸浮培養(yǎng)細胞最佳起始密度為2.5×104個·mL－1，最適合懸浮細胞的培養(yǎng)。

表2 不同起始密度對懸浮細胞系生長的影響

3.3 培養(yǎng)時間對櫻花懸浮細胞生長的影響

不同的培養(yǎng)時間對櫻花細胞懸浮培養(yǎng)也會產(chǎn)生影響，櫻花細胞在營養(yǎng)充足的情況下，開始快速地有絲分裂，細胞的數(shù)目隨著時間的變化而變化。通過培養(yǎng)、觀察、計數(shù)，得到其數(shù)目變化的結果見圖3。

圖3 培養(yǎng)時間對懸浮培養(yǎng)的影響

由圖3可知，懸浮培養(yǎng)細胞生長曲線呈現(xiàn)拋物線型，2～6d生長緩慢，8～14d進入對數(shù)生長期，并趨于穩(wěn)定，達到最大值1.673×106個／mL，14d以后呈現(xiàn)下降的趨勢。因此最佳培養(yǎng)時間為14d，櫻花細胞懸浮培養(yǎng)的繼代周期為10～14d。

3.4 搖床轉速對細胞懸浮培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)愈傷組織的搖床轉速對其增殖量也有影響。30、50、70、90、110r／min，隨著轉速的增加，懸浮培養(yǎng)細胞增殖量也逐漸增加，但當轉速超過130r／min后，懸浮培養(yǎng)細胞增殖量開始下降，原因有待進一步研究。因此確定愈傷組織適宜進行懸浮培養(yǎng)的搖床轉速為120r／min。

4 結語

利用櫻花嫩莖為外植體進行愈傷組織的誘導，進而建立櫻花細胞懸浮培養(yǎng)體系，試驗結果表明：愈傷組織以 MS＋1.0mg／L 6－BA＋2.0mg／L NAA＋1.0mg／L2，4－D液體培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度26℃，搖床轉速120r／min，細胞懸浮培養(yǎng)細胞最佳起始密度為2.5×104個·mL－1，培養(yǎng)14d，細胞懸浮培養(yǎng)達到最佳值。本實驗初步確定了櫻花細胞懸浮培養(yǎng)的條件，試驗后期細胞系的穩(wěn)定性較差，可能是由于激素的配比影響，本研究將繼續(xù)補充相關試驗，以提高櫻花細胞懸浮培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性，為櫻花組織快繁的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化發(fā)展提供可靠的技術服務平臺。

［1］呂月良，陳 樟，施季森.福建山櫻花研究現(xiàn)狀、開發(fā)前景與育種策略［J］.南京林業(yè)大學學報：自然科學版，2006，30（1）：115～118.

［2］王光萍，黃敏仁.福建山櫻花的組織培養(yǎng)及植株再生［J］.南京林業(yè)大學學報：自然科學版，2002，26（2）：73～75.

［3］呂月良，陳 璋，施季森，等.福建山櫻花不定芽誘導和植株再生規(guī)模化繁殖試驗［J］.南京林業(yè)大學學報：自然科學版，2006，30（3）：105～108.

［4］和鳳美，朱永平，楊曉紅，等.冬櫻花愈傷組織誘導和抑制褐化初探［J］.中國農(nóng)學通報，2010，26（12）：130～134.

［5］王艷紅，龔束芳，車代弟.豐花月季愈傷組織的誘導及細胞懸浮培養(yǎng)［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2007，38（2）：161～165.

［6］吳春霞.植物細胞懸浮培養(yǎng)的影響因素［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37（1）：36～38.