豬偽狂犬疫苗研究進展

劉濤，趙京媛，孫曉成

(1.天津瑞普生物技術股份有限公司，天津 300300；2.河北省寧晉畜牧獸醫管理辦公室，河北邢臺 055550)

瑞普(( 保定))生物藥業有限公司

目前，疫苗接種是預防、控制甚至消滅豬偽狂犬病主要的措施之一。國內外已研制出豬偽狂犬病的滅活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已經相對成熟，而病毒載體重組疫苗、核酸疫苗、亞單位疫苗尚處于實驗室研究階段。本文對豬偽狂犬疫苗做簡要綜述。

一、滅活疫苗

滅活疫苗是將豬偽狂犬病毒接種于雞胚或細胞，當病毒滴度達到要求時收獲病毒，滅活后加入免疫佐劑，從而制成滅活疫苗。

1.滅活疫苗優點。安全性高，不會引起散毒，也不會帶來潛伏感染的問題。

2.滅活疫苗缺點。滅活疫苗不能將內源性蛋白抗原提呈給免疫系統，因而不能誘導細胞毒T細胞反應(CTL)。皰疹病毒本身的免疫原性與毒力有一定的相關性，因此滅活疫苗的免疫 效果一般較差，并且滅活疫苗使用的免疫劑量較大，偶爾會發生過敏反應，故在生產上已經較少應用。

二、自然缺失弱毒活疫苗

弱毒活疫苗是將分離到的野毒株經非豬源細胞反復傳代，或適應雞胚，或加入致突變劑在高于一般的培養溫度條件下，在細胞上反復傳代而獲得的疫苗，如匈牙利的Bartha株、羅馬尼亞的Bucharest株、BUK株、TK200株、北愛爾蘭的NIA4株、法國Alfort-26株、前蘇聯的VGNK-I株、保加利亞MK25株、南斯拉夫的Bkal68株和Govacc株等弱毒株。目前使用較多的是Bartha、Buk毒株。

我國目前廣泛使用的PR弱毒凍干疫苗(Bartha-k61)是一種gI／gE雙基因缺失弱毒疫苗，由于該基因缺失而進一步阻斷弱毒株回復毒力的可能性，所以大大提高了這種弱毒苗的安全性。

1.自然缺失弱毒活疫苗的優點。弱毒苗具有良好的免疫原性，而且價格低廉，至今仍在偽狂犬病的防控中起著重要的作用。

2.自然缺失弱毒活疫苗的缺點。未經充分致弱的弱毒苗的毒力可能會返強而導致疾病的流行；弱毒疫苗可建立潛伏感染，并有可能散毒。

三、基因工程疫苗

隨著分子生物學的發展，豬偽狂犬病病毒的基因組結構、基因缺失對病毒生物學性質和免疫原性的影響得到了廣泛研究，豬偽狂犬基因工程疫苗的研究得到更深入的發展。豬偽狂犬基因工程疫苗包括：基因工程缺失弱毒活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組病毒疫苗。

(一)基因工程缺失弱毒活疫苗豬偽狂犬基因缺失主要包括對與毒力相關的基因如TK、RR、gE、gl等基因的缺失以降低病毒毒力；對糖蛋白基因如gG、gC、gD等基因的缺失以引入選擇標記或阻止感染性病毒的產生，從而致弱豬偽狂犬病毒，同時又保持其較強的免疫原性。基因工程缺失疫苗的研制始于20世紀80年代初。

1.第一代基因缺失疫苗。第一代基因缺失疫苗指缺失PRV一個主要的毒力基因獲得的疫苗。1984年，Kit等以PRV BUK為起始材料，并以BUK疫苗株為親本，通過缺失TK基因序列中的148bp片段，構建出PRV的TK缺失株PRV BUK-d13株。試驗證明，該疫苗對豬是安全的，并能提供有效的保護，5～6周齡豬在免疫接種后能產生中和抗體，在攻毒后能表現出再次免疫應答。Quint等 對 PRV NIA-3株 的US區進行部分缺失(gE基因缺失)，構建的PRV突變株能明顯降低PRV對小鼠和10周齡仔豬的毒力，可使免疫豬能抵抗強毒的致死攻擊。但該突變株對3日齡仔豬仍具有較強的毒力。華中農業大學陳煥春等構建了PRV Ea株TK基因缺失株；四川農業大學郭萬柱等構建了PRV閩A株TK基因缺失株，免疫小鼠有一定的保護作用。TK基因缺失疫苗不僅能較好地免疫豬只，而且免疫豬后還可以通過PCR的方法將免疫接種豬與自然感染豬區分開來。但是，由于TK基因屬于酶蛋白基因，在體內不能產生其相應的抗體，因此僅缺失TK基因不能用血清學方法區別開免疫接種豬與自然感染豬，要將此區別開來必須缺失相應的糖蛋白基因。鑒于此，許多學者在TK基因缺失的基礎上又缺失了相應的糖蛋白基因而構建了含TK基因缺失的雙缺失和多缺失疫苗株。

2.第二代基因缺失疫苗。第二代基因缺失疫苗除了在TK基因引入了一個缺失外，在非編碼必需糖蛋白的基因內引入了一個新的缺失。或插入一個報告基因，這樣得到的突變株就不能產生被缺失的糖蛋白，因而免疫動物就不能產生相應的抗體，因此可以通過血清學方法將免疫接種豬與自然感染野毒的豬相區別。這也是第二代基因缺失疫苗的最顯著特點。還值得注意的是有些糖蛋白的缺失，可以進一步降低毒力。第一個申請專利并注冊使用的PRV基因工程疫苗OM-NIVACPRV就是TK基因缺失疫苗。在我國，陳煥春等在PRV Ea TK-株基礎上構建了PRV Ea TK-/gG-、TK-/gE-疫苗株。四川農業大學的郭萬柱等構建了PRV閩A TK一／gC一、TK一／gE一等毒株。其中應用較多的有TK一／gC一、TK一／gD一、TK一／gE一、TK－／gC一等雙缺失疫苗株和TK一／gE－／gG－三缺失疫苗株。經增殖能力、安全性、毒力穩定性和免疫原性測定結果表明，這些疫苗株具有較好的安全性；良好的遺傳穩定性；很強的免疫原性。2003年郭萬柱主持研制的豬偽狂犬病基因缺失活疫苗SA215株正式獲得國家新獸藥證書。致細胞病變效應、安全性、免疫原性和接種動物抗體消長規律等生物學特性測定及田間試驗結果顯示，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。

近幾年，GFP作為報告基因而引起了廣泛的注意，該報告基因編碼綠色熒光蛋白，能自身催化形成發光結構并在藍光激發下發出綠色熒光，因而是一種全新的報告分子。

上述基因缺失疫苗的構建成功，為偽狂犬病的根除計劃打下了物質基礎。除此之外，人們還將注意力集中在核苷酸還原酶(RR)、蛋白激酶(PK)、堿性酸外切酶、脫氧尿苷三磷酸激酶等與PRV毒力相關的基因上，試圖通過缺失這些基因，更進一步地降低疫苗毒株的殘余毒力，從而使突變株更為安全。

(1)基因工程缺失弱毒活疫苗優點：都缺失了目的基因的幾百甚至幾千個堿基，缺失區域明確，所以它們返祖的可能性極小。PRV缺失株一般都缺失了一個或幾個毒力基因，所以大多數PRV缺失株對鼠、豬無毒力或僅有較低的毒力，但是，僅缺失TK基因的弱毒株對犢牛還有較低的毒力，而對貓、狗毒力較強，若同時再缺失gC或gE基因，則幾乎不表現出毒力。大多數的PRV缺失疫苗株都有較強的免疫原性，免疫動物都獲得了較強的保護力。強毒攻擊免疫豬只出現臨床癥狀和增重受阻，而豬只的排毒時間大大縮短，排毒量也大大降低。

(2)基因工程缺失弱毒活疫苗缺點：基因缺失疫苗能否引起潛伏感染或被激活為感染性病毒令人擔憂。基因缺失疫苗在動物體內與野毒或不同的基因缺失疫苗間發生基因重組而突變成強毒株，從而成為新的傳染源，這種可能性是存在的。基因缺失疫苗在接種后也存在潛伏感染和排毒的問題。

(二)亞單位疫苗 亞單位疫苗是利用PRV保護性抗原基因，在原核或真核系統中表達所獲得的產物制成的疫苗。目前已經發現PRV有11種糖蛋白，其中，gB、 gC、gD均為刺激機體產生中和抗體的蛋白，所產生的抗體無論是在體內、體外，還是在有無補體存在的情況下都有中和PRV的能力，因此，gB、gC、gD是研制PRV亞單位疫苗的首選糖蛋白。

Marchioli等將PRV保護性抗原基因gD插入到人巨細胞病毒啟動子的下游，然后轉入中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中，經氨喋呤篩選出1株表達gD蛋白的CHO gD-l7細胞株，經大量培養后用表達產物配以佐劑，免疫小鼠能產生較高滴度的抗體，免疫3次后攻毒，小鼠能抵抗強毒攻擊。鼻內接種免疫豬，能誘導豬產生中和抗體并保護豬抵抗PRV強毒的攻擊。Katayama等(1991)用肝素親和層析純化的gC和用免疫親和層析純化的gB、gC、 gD分別接種豬，均能使其抵抗PRV的攻擊。

1.亞單位疫苗的優點。不含有核酸物質因此比較安全，接種后不會產生持續感染或潛伏感染。產生的免疫應答可以與野毒感染相區分，有利于疫病的控制和消滅。

2.亞單位疫苗的缺點。生產成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及滅活疫苗，應用受到限制。

(三)核酸疫苗 核酸疫苗是指將編碼外源蛋白質的核酸表達載體注射入機體，以激發機體產生針對外源蛋白質特異性的免疫應答。Gerdts等將PRV gC或gD基因置于人巨細胞病毒的主要立即早期啟動子下游構建了DNA疫苗。用表達gC的核酸疫苗免疫能完全保護豬抵抗PRV-75V19毒株的致死性攻擊，并能保護豬部分抵抗PRV強毒NIA-3株的攻擊；但用表達gD的核酸疫苗免疫卻不能保護豬抵抗PRV強毒株的攻擊。用gC核酸疫苗肌肉或皮下免疫3次，在血清中能檢測到抗gC的抗體，并可使豬對NIA-3產生部分保護，還能產生特異性細胞免疫應答。Montail等(1996)構建了含PRV gD基因的真核表達質粒。以其接種新生仔豬，結果顯示，未曾加強免疫過的仔豬和經過加強免疫的仔豬，都能夠產生中等水平的中和抗體，但對PRV的攻擊不具保護力。編碼gB的DNA疫苗可誘導豬的細胞免疫并減少排毒。

1.核酸疫苗的優點。能克服偽狂犬病病毒的潛伏感染，安全性高，免疫期長，而且能激發細胞免疫。

2.核酸疫苗的缺點。雖然核酸疫苗的免疫能產生較高的抗體水平，但對強毒攻擊的保護力不理想，因此，核酸疫苗的廣泛應用還有一段漫長的路要走。

(四)重組疫苗

1.以腺病毒為載體的重組疫苗。ELA基因編碼腺病毒的主要轉錄激活因子，因此ELA－腺病毒在不表達ELA的細飽中，不能復制。Hammond JM等以這種復制缺陷型腺病毒為載體構建了1株表達PRVgD的ELV-重組腺病毒PRV-gD。用該重組病毒通過多種途徑分別接種兔和小鼠，均能產生對gD的免疫應答。一些免疫接種的動物可以抵抗致死量PRV的攻擊；豬接種重組病毒能產生高水平的抗gD抗體，并能有效抵抗強毒的攻擊。

2.以豬痘病毒為載體的重組疫苗。豬痘病毒甚因組容量大，可以插入較大的或多個外源片段。由于豬是其唯一宿主，因此，豬痘病毒作為載體，除了具有痘病毒載體的優越性外，還具有豬宿主特異性的特點。Van dre Leek等，(1999)將PRV gD和gI基因插入豬痘病毒中，用獲得的重組病毒接種豬，能使豬獲得對PRV強毒攻擊的保護。

3.豬偽狂犬病毒載體。豬的重組疫苗大多是以豬偽狂犬病毒為載體。PRV是雙鏈DNA病毒，基因組長達150Kb，其中存在許多病毒復制非必需的基因，允許插入外源基因，這表明PRV本身就是潛在的病毒載體。最近PRV己被構建成表達外源基因的強有效的表達載體。盡管這些載體還沒有一種獲得實際應用，但是(缺失gE)被標記的PRV與經典豬瘟的重組病毒確實有助于用一種疫苗免疫來同時預防這兩種豬的毀滅性疾病。已確定了許多不同的位點可以用于插入幾種不同的外源基因。

Van Ziji等成功地構建了表達HCV E1基因的重組PRV疫苗株。重組病毒免疫后，保護豬不僅能抵抗PRV攻毒，而且能抵抗HCV致死性的攻毒。因此，用一種病毒疫苗能夠預防豬的2種重要的病毒性疾病。Peeters等把CSFV E2基因整合于PRV gE基因缺失突變株的gD位點，構建了表達E2的gE、gD雙基因缺失重組病毒。這種重組病毒作為雙價疫苗，能使豬同時獲得對PRV和CSFV兩種強毒致死攻擊的保護。由于gD基因的缺失，從而阻止了感染性PRV的產生，從而解決了重組病毒的生物安全問題。但比較而言，這種重組病毒的保護效果較差。

4.重組疫苗的優點。載體病毒較穩定，免疫原性持久，刪除毒力基因的活載體疫苗能誘發體液免疫和細胞免疫，避免了滅活苗免疫的缺點，接種方便安全。

5.重組疫苗的缺點。有些載體對人或動物具有潛在致病性，對人或動物具有潛在的威脅。另外，重復使用會使動物對載體病毒產生免疫反應。

四、結語

豬偽狂犬病極大地危害著世界各國的養殖業，獸醫工作者已在豬偽狂犬疫苗的各個方面做了大量工作，也取得了令人欣喜的成果，在PR的防制工作中起到了不可估量的作用。在豬偽狂犬的眾多疫苗中，基因缺失疫苗免疫能與自然感染相區分，一些國家已推廣使用基因缺失疫苗(多為gE-表型)免疫豬群，配以相應的鑒別診斷方法來實施豬偽狂犬凈化計劃，并取得較理想的成果。此外，由于PRV毒力受多基因控制，病毒毒力的致弱往往伴有疫苗免疫保護效果的降低。因此，在進一步揭示PRV基因組結構和功能、基因表達調控及其誘導機體免疫應答機理的基礎上構建新的缺失突變株疫苗和發展雙價或多價載體疫苗將是今后豬偽狂犬疫苗發展的主要方向。隨著分子生物學研究的不斷發展和基因工程技術的廣泛應用，豬偽狂犬疫苗的研究可望在不久的將來會有更新的突破。

略)