NJO抑制腫瘤細胞增殖的效力及其作用機制

任 宏，龍啟才

(1.廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520;2.中山大學藥學院，廣東 廣州 510006)

自從流行病學研究發現長期小劑量服用阿司匹林可以預防家族性多發性結腸息肉的癌變，就開始了非甾體類抗炎藥的抗腫瘤研究［1－4］。非甾體類抗炎藥主要是通過抑制前列腺素合成的限速酶環氧化酶的活性發揮作用。20世紀80年代末發現環氧化酶存在Ⅰ型和Ⅱ型2種同工酶［5］。選擇性環氧化酶Ⅱ型抑制劑既可以發揮非甾體類抗炎藥的抗腫瘤藥理作用［6］，又可以避免這類藥物的胃腸道相關毒副反應，成為抗腫瘤藥物的研究熱點。鄰吡啶醌二取代衍生物(m-pyridine-quinone two replace derivatives，NJO)是由中山大學藥學院和香港科技大學聯合開發的新型選擇性環氧化酶Ⅱ型抑制劑(專利號:CN02130161.1)，本課題主要研究了NJO體內外的抗腫瘤作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品 NJO由中山大學藥學院提供，4℃保存。NJO用DMSO溶解，現用現配，加藥后溶液中DMSO的終濃度＜0.25%。

1.2 細胞株 人結腸腫瘤細胞株HT-29，購自中山大學藥學院動物中心;人肺腫瘤細胞株Glc-82、人肝腫瘤細胞株Bel-7402，由中山大學腫瘤研究所惠贈;人肝腫瘤細胞株HepG2，由中山大學第二附屬醫院中心實驗室惠贈。所有細胞于37℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱中，DMEM培養基加體積分數5%小牛血清常規細胞培養。

1.3 NJO對4種腫瘤細胞株的體外抑制實驗［7］取處于指數生長期的 Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG2細胞，質量分數0.25%胰酶消化，吹散成均勻的單細胞懸液，200 μL接種于 96 孔板，貼壁后分別加 0.5 μL終濃度分別為 0.725、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 g·L－1的 NJO，DMSO 作為陰性對照，5.000、10.000、20.000、40.000、80.000、160.000 μmol·L－1終濃度的塞來昔布作為陽性對照。采用噻唑藍(MTT)法測定各組培養后OD值，取各組平均數計算存活率，公式如下:存活率=(試驗孔OD值/空白對照組OD值)×100%

1.4 透射電鏡下細胞形態觀察［8］取對數生長期的4種細胞4 mL，分別培養在50 mL的培養瓶中待細胞完全長滿。加入藥物40 g·L－1的 NJO 10 μL。放入到培養箱中孵育48 h后，移走培養基，用胰酶消化細胞并收集到離心管中，離心10 min，吸掉上清液，制成5 mL重懸細胞。將細胞團投入到含有戊二醛的透射電鏡固定液中4℃保存。用PBS洗1次后加入質量分數1%鋨酸固定30 min，常規電鏡樣品制備程序脫水、滲透、包埋細胞制成臘塊，用超薄切片機切片，鈾鉛染色。在透射電鏡下觀測加藥后細胞內的變化。

1.5 DNA片段電泳圖分析 取對數生長期的4種細胞4 mL，分別培養在50 mL的培養瓶中待細胞完全長滿。加入40 g·L－1藥物10 μL。放入到培養箱中孵育48 h后移走培養基，收集到離心管中，以1000 r·min－1的速率收集上清液中細胞，離心后將離心管中上清液棄掉。細胞移入EP管(1 mL)中，加入細胞裂解液(細胞裂解液含 10 mmol·L－1Tris-Hcl、1 mmol·L－1EDTA 和 2 g·L－1TritonX-100，pH 7.5)0.3 mL。細胞培養瓶中的細胞用冷PBS洗2次，直接加入細胞裂解液0.3 mL放入到4℃的冰箱中20 min。之后以12000 r·min－1的速率離心10 min。吸取上清液加入等體積的酚和氯仿的混合液(體積比為1∶1)，抽提1次，以12000 r·min－1的速率離心10 min取上清液。將上清液中加入300 mmol·L－1的乙酸鈉和等體積異丙醇沉淀過夜。2000 r·min－1的速率離心后收集沉淀，體積分數70%乙醇洗2次，干燥后加入Tris-Hcl 10 mmol· L－1、EDTA 1 mmol· L－1和0.6 g·L－1的 Rnase，在37 ℃的水浴箱中孵育30 min。樣品放到－20℃的冰箱中保存。將樣品在質量分數1.0%瓊脂糖凝膠上電泳1 h，電泳采用40 mV的低電壓。溴化乙錠染色后用GDS自動照相儀器拍照，進行電泳圖像分析。

1.6 流式細胞儀分析［9］取對數生長期的HepG2細胞株用胰酶消化后，調整細胞濃度為5×105mL－1，取4 mL裝于50 mL的細胞培養瓶中。貼壁12 h后加入藥物 NJO 10 μL(20 g·mL－1)，陰性對照組加入等體積的DMSO溶液，陽性對照組加入20 μL的塞來昔布。每孔設有1個平行孔。分別收集加入藥物0、12、24、48 h各時間點的細胞。離心后加入0.3 mL PBS混勻，加入4℃的無水乙醇，－20℃條件下固定過夜。用PBS在常溫下洗2次，最后與1 mL的含有PI的PBS染色混勻后在4℃條件下避光放置30 min(15 mg·L－1，0.5%Tween-20，2.5 μg Rnase)，上流式細胞儀檢測，記錄激發波長488 nm處的紅色熒光。

2 結果

2.1 MTT法實驗結果 結果顯示NJO可以顯著抑制 Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG24 種腫瘤細胞的增殖。對于 4種腫瘤細胞株的 IC50分別為 101 μmol·L－1(13.90 g·L－1)、104 μmol·L－1(14.20 g·L－1)、201 μmol· L－1(27.00 g · L－1)、140 μmol·L－1(19.00 g·L－1)。而陽性對照塞來昔布對Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG2 的 IC50分別為 76 μmol·L－1、73 μmol·L－1、89 μmol·L－1、98 μmol·L－1。提示NJO可能對多種腫瘤細胞株均有抑制作用。見表1。

2.2 NJO抑制腫瘤生長的機制

2.2.1 透射電鏡下觀察結果 NJO作用后誘導細胞凋亡早期的染色質的變化，染色質固縮，核皺縮，細胞整體體積變小(圖1A)。接著細胞核進一步固縮(圖1B)，聚集于核膜邊界上形成境界分明的塊狀，圍繞整個核膜環狀排列，形成凋亡所特有的環狀分布。核膜破裂，細胞核分成3～4個小核，細胞漿濃縮或裂解成質膜包繞碎片，細胞質中可見較完整的細胞器(如高爾基體、內質網等)，細胞膜內陷。細胞體積進一步縮小(圖1C)，最終可見凋亡小體形成(圖1D)。透射電鏡觀察結果還顯示NJO作用細胞48 h后呈現出凋亡不同時期的不同形態特征。提示NJO可以明顯誘導細胞凋亡的數量增加。

2.2.2 DNA電泳結果 NJO作用48 h后，對 Bel-7402、Glc-82、HT-29、HepG24 種細胞的 DNA 片段進行提取，DNA瓊脂糖凝膠電泳法的結果顯示電泳帶上呈現有等倍距離的梯狀條帶，DNA片段長度為180～200 bp之間。梯狀條帶是凋亡細胞所特有的生化特征，與壞死時的呈模糊片狀條帶差異明顯。提示NJO主要是通過誘導4種腫瘤細胞凋亡的途徑來達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。見圖2。

表1 NJO作用48 h時4種腫瘤細胞的存活率及其IC50

圖1 40 g·L－1NJO作用于HepG2細胞24 h后細胞形態變化

2.2.3 流式細胞儀測定結果 結果顯示給藥20 g·L－1后6 h G1峰的左側出現亞二倍體細胞群的峰形，12 h后細胞凋亡率為27.9%。隨著時間的推移亞二倍體峰形增大，在給藥后24 h達到最大，此時的細胞凋亡率為49.7%，同時G0期峰形逐漸增大，多數細胞阻滯在G0期，細胞周期分配改變。48 h后多數細胞死亡，出現細胞死亡的峰形。在細胞周期中不同時期，細胞數量均有不同程度的減少，亞二倍體的細胞數量的多少不等。見圖3。

3 討論

腫瘤組織環氧化酶Ⅱ型蛋白的高表達促使人們在環氧化酶Ⅱ型抑制劑中尋找抗腫瘤藥物。NJO是新開發的選擇性環氧化酶Ⅱ型抑制劑。對環氧化酶Ⅱ型的選擇性與塞來昔布接近，選擇倍數超過300倍，而對于環氧化酶Ⅰ型的選擇性只有100倍［6］。其抗腫瘤作用值得研究。本研究采用MTT法發現NJO可明顯抑制4種腫瘤細胞的增殖，藥物濃度與抑制率存在一定范圍的濃度依賴性，是一種有前途的抗腫瘤藥物。同時NJO對多種腫瘤細胞增殖有抑制作用，抗瘤譜較廣，具有潛在的開發價值。在進一步探討抗腫瘤作用機制時，通過加藥后觀察腫瘤細胞形態學的變化、DNA片段瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞儀的數據結果發現NJO主要是通過阻滯腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡的途徑來達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。提示NJO可以作為各種腫瘤的輔助治療，臨床意義重大。

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