甘精胰島素、地特胰島素、人胰島素對3T3－L1脂肪細(xì)胞PPARγ2mRNA表達(dá)的影響

姬海濤，楊 靜

糖尿病及其并發(fā)癥對靶器官（心、腦、腎等）的損傷，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生活質(zhì)量。良好的血糖控制能夠顯著減少和延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。長效胰島素類似物延長了作用時(shí)間，無明顯峰值，個(gè)體內(nèi)變異小，更好的模擬了正常胰島素的分泌。胰島素可以提高前脂肪細(xì)胞的分化率，在前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起著相當(dāng)重要的作用。脂肪細(xì)胞的體積增大、數(shù)量增多或兩者同時(shí)存在可引起脂肪組織增加。研究表明，僅少量的體重降低即可能降低糖尿病患者罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。目前，對胰島素類似物的對比研究大多以臨床研究為主，而基礎(chǔ)研究甚少。胰島素與其類似物對脂肪細(xì)胞的影響是否相同呢？本研究采用甘精、地特兩種長效胰島素類似物和人胰島素分別誘導(dǎo)體外3T3－L1前脂肪細(xì)胞分化，檢測PPARγ2mRNA表達(dá)的變化，探討胰島素對PPARγ2mRNA調(diào)節(jié)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)用品與化學(xué)試劑 DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司；胎牛血清（FCS）購自杭州四季青生物有限公司；青霉素、鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；人胰島素、3－異丁基－1－甲基－黃嘌呤（IBMX）、三碘甲狀腺原氨酸（T3）、地塞米松、二甲基亞砜（DMSO）均購自Sigma公司；地特胰島素由諾和諾德公司提供；甘精胰島素由甘李藥業(yè)有限公司提供；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；RT－PCR試劑盒購自Fermentas公司；Fast Start U－niversal SYBR Green Master（ROX）購自Roche公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3T3－L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 將3T3－L1前脂肪細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，用含有10%FCS的DMEM／F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，48h換液一次，待細(xì)胞融合生長后按1∶2傳代，取同代的對數(shù)生長期細(xì)胞，將細(xì)胞按照5×104／mL接種于6孔培養(yǎng)板。待細(xì)胞達(dá)到90%貼壁后加入分化培養(yǎng)基，其中含胰島素（每組分別含有人胰島素、甘精胰島素、地特胰島素100nmol／L、500nmol／L、1 000nmol／L，另設(shè)對照組為10nmol／L人胰島素），地塞米松250nmol／L、T3 0.2nmol／L、IBMX 0.5mmol／L，前4d用含IBMX的分化培養(yǎng)基，后6d用不含IBMX的分化培養(yǎng)基。每天觀察，隔48h換液。10d后超過90%的細(xì)胞成脂肪細(xì)胞表達(dá)。

1.2.2 RT－PCR方法檢測PPARγ2mRNA的表達(dá) 用Trizol試劑裂解細(xì)胞提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照試劑說明。PPARγ2上游引物：5′－CTCCTGTTGACCCAGAT－3′，下游引物：5′－AATGCGAGTGGTCTTCCATC－3′，擴(kuò)增片段長度：120bp；內(nèi)參基因GAPDH 上游引物：5′－TGAACGGGAAGCTCACTGG－3′，下游引物：5′－TCCACCACCCTGTTGCTGGA－3′，擴(kuò)增片段長度：307bp。PCR反應(yīng)體系：cDNA 5.0μL，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（ROX）25.0μL，上下游引物各0.5μL，用DEPC－H2O補(bǔ)足至50μL體積。PCR反應(yīng)條件：PPARγ2 95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸1min，40個(gè)循環(huán)。用Ct值表示目的基因的擴(kuò)增長度，用2－△△Ct對mRNA水平進(jìn)行相對定量分析。△△Ct＝（△Ct目的基因－△Ct標(biāo)準(zhǔn)值），其中△Ct目的基因＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)3孔重復(fù)（N＝3，n＝3）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組定量資料比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用LSD－t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 相同胰島素不同濃度對3T3－L1脂肪細(xì)胞PPARγ2mRNA表達(dá)的影響 以對照組（10nmol／L）mRNA表達(dá)值為1。與對照組相比，三組PPARγ2mRNA表達(dá)隨胰島素濃度的升高而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，人胰島素、甘精胰島素、地特胰島素均可促進(jìn)PPARγ2mRNA的表達(dá)，在該實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，基因的表達(dá)隨著濃度的增加而增加。詳見表1。

表1 相同胰島素不同濃度對3T3－L1脂肪細(xì)胞PPARγ2mRNA表達(dá)的影響（x±s）

2.2 相同濃度下不同胰島素對3T3－L1脂肪細(xì)胞PPARγ2 mRNA表達(dá)的影響 三組胰島素間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相同濃度的三種胰島素均促進(jìn)PPARγ2mRNA的表達(dá)，其中人胰島素對PPARγ2mRNA表達(dá)促進(jìn)的作用最強(qiáng)，而地特胰島素最弱。詳見表2。

表2 相同濃度下不同胰島素對3T3－L1脂肪細(xì)胞PPARγ2mRNA表達(dá)的影響（x±s）

3 討 論

糖尿病治療中胰島素發(fā)揮著重要的作用。它能夠有效地控制血糖，以預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。以甘精胰島素和地特胰島素為代表的長效胰島素類似物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床。他們共同的特點(diǎn)是通過基因工程方法產(chǎn)生，緩慢穩(wěn)定吸收，無明顯波峰波谷，變異性小，模擬了基礎(chǔ)胰島素的分泌。但他們在分子結(jié)構(gòu)、長效機(jī)制等方面又有諸多不同。甘精胰島素是在天然人胰島素A鏈21位以甘氨酸代替天冬酰胺，B鏈的C末端添加了兩分子精氨酸；地特胰島素去掉了天然人胰島素30位的蘇氨酸殘基，并在B鏈29位賴氨酸的殘基上以共價(jià)鍵連接一個(gè)肉豆蔻酸側(cè)鏈。脂肪組織可通過調(diào)節(jié)能量利用、發(fā)揮內(nèi)分泌功能等在代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。由于脂肪細(xì)胞的體積增大、數(shù)量增多或兩者同時(shí)存在可引起脂肪組織增加，從而影響代謝的調(diào)節(jié)［1］。在前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化成脂肪細(xì)胞中胰島素的作用相當(dāng)重要。胰島素可以提高前脂肪細(xì)胞的分化率，促進(jìn)脂肪的積聚［2］。

前脂肪細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞，其過程有三個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 PPARγ、SREBP－1C／ADD1、C／EBPs 進(jìn) 行 調(diào) 控［3］，其 中PPARγ最具有脂肪組織特性，并先于大多數(shù)脂肪基因而表達(dá)，是誘導(dǎo)脂肪分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子。PPARγ的表達(dá)可以引起對數(shù)生長期成纖維細(xì)胞系的生長停滯，并且開啟脂質(zhì)形成，是脂肪細(xì)胞分化的必要條件［4，5］，它在前脂肪細(xì)胞中不表達(dá)，其表達(dá)隨脂肪細(xì)胞的分化而增加，至成熟脂肪細(xì)胞達(dá)到最高，在前脂肪細(xì)胞－脂肪細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。PPARγ基因轉(zhuǎn)錄時(shí)由于啟動(dòng)子和拼接方式的不同而分成PPARγ1、2、3，3種亞型，其中PPARγ2主要在脂肪組織表達(dá)，因此在脂肪細(xì)胞分化過程中PPARγ2的作用尤其重要。

考慮到在脂肪細(xì)胞分化過程中胰島素是必備條件，在本項(xiàng)研究中，選用加入10nmol／L的人胰島素的分化培養(yǎng)基作為對照組。分別選用了100nmol／L、500nmol／L、1 000nmol／L的人胰島素、甘精胰島素、地特胰島素做比較。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3T3－L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞過程中，PPARγ2 mRNA的表達(dá)隨著胰島素濃度的增高而增多，這說明了人胰島素、甘精胰島素、地特胰島素均促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化，且分化程度隨著胰島素濃度的增加而提升；通過同濃度不同胰島素的比較得知，人胰島素促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化的作用強(qiáng)于甘精胰島素，而甘精胰島素又強(qiáng)于地特胰島素。Anja等［6］采用人胰島素、地特胰島素誘導(dǎo)3T3－L1前脂肪細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人胰島素干預(yù)下的甘油－3磷酸脫氫酶活性增加了200倍，地特胰島素對前脂肪細(xì)胞PPARγ2表達(dá)的影響弱于人胰島素；García－Escobar等［7］的實(shí)驗(yàn)得出地特胰島素對前脂肪細(xì)胞PPARγ的影響弱于甘精胰島素及其他胰島素類似物，表明脂肪細(xì)胞對地特的敏感性弱于其他胰島素類似物，這些結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。而多項(xiàng)臨床試驗(yàn)也已證實(shí)地特胰島素可以減輕糖尿病患者胰島素治療引起的體重增加［8－10］，考慮可能與成熟脂肪形成減少進(jìn)而降低了外周脂肪含量有關(guān)。García－Escobar還認(rèn)為甘精胰島素提高了激素敏感脂肪酶（hormone senstive lipase，HSL）基因表達(dá)從而使分化增強(qiáng)；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（sterol regulatory element binding protein－1c，SREBP－1c）誘導(dǎo)3T3－L1細(xì)胞系表達(dá)PPAR，胰島素可能通過影響SREBP－1c從而影響PPARγ的表達(dá)［7］；脂肪細(xì)胞的分化成熟需要葡萄糖，Wada等［11］發(fā)現(xiàn)地特胰島素對葡萄糖的攝取會(huì)減少用于脂肪細(xì)胞的葡萄糖；Kurtzhals等［12］實(shí)驗(yàn)得出人胰島素與胰島素受體的親和力強(qiáng)于甘精胰島素，地特胰島素親和力最弱。以上的觀點(diǎn)均為胰島素影響細(xì)胞分化的可能機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)通過使用不同胰島素上調(diào)了PPARγ2基因的表達(dá)從而促進(jìn)前脂肪細(xì)胞分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，表明不同胰島素對脂肪細(xì)胞分化的影響不盡相同，有助于結(jié)合臨床根據(jù)個(gè)體差異選擇胰島素治療。

［1］ Camp HS，Ren D，Leff T.Adipogenesis and fat－cell function in obesity and diabetes［J］.Trends Mol Med，2002，8（9）：442－447.

［2］ Sato K，Nakanishi N，Mitsumoto M.Culture condition supporting adipocyte conversion of stromal－vascular cells from bovine intramuscullar adipocyte tissues［J］.J Vet Med Sci，1996，58：1073－1078.

［3］ Mansen A，Guardio－Diaz H，Rafter J，etal.Expression of the peroxisome proliferator－activated receptor（PPAR）in the mouse colonic mucosa［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，222（3）：844－851.

［4］ Altiok S，Xu M，Spiegelman BM.PPARgamma induces cell cycle withdrawal：Inhibition of E2F／DP DNA－binding activity via downregulation of PP2A［J］.Genes Dev，1997，11：1987－1998.

［5］ Berger JP，Akiyama TE，Meinke PT.PPARs：Therapeutic targets for metabolic disease［J］.Trends Pharmacol Sci，2005，26（5）：244－251.

［6］ Anja B，Harald S，Anita MH，etal.Effect of insulin detemir，compared to human insulin，on 3T3－L1adipogenesis［J］.Regulatory Peptides，2008，151：160－163.

［7］ García－Escobar E，Rodríguez－Pacheco F，Haro－Mora JJ，etal.Effect of insulin analogues on 3t3－11adipogenesis and lipolysis［J］.Eur J Clin Invest，2011，41（9）：979－986.

［8］ Ra?lováK，Bogoev M，Raz I，etal.Insulin detemir and insulinaspart：A promising basal－bolus regimen for type 2diabetes［J］.Diabetes Res Clin Pract，2004，66：193－201.

［9］ Haak T，Tiengo A，Draeger E，etal.Lower within－subject variability of fasting blood glucose and reduced weight gain with insulin detemir compared to NPH insulin in patients with type 2diabetes［J］.Diabetes Obes Metab，2005，7（1）：56－64.

［10］ Hollander P，Cooper J，Bregnhoj J.A 52－week，multinational，open－label，parallel－group，noninferiority，treat－to－target trial comparing insulin detemir with insulin glargine in a basalbolus regimen with mealtime insulin aspart in patients with type 2diabetes［J］.Clin Ther，2008，30（11）：1976－1987.

［11］ Wada T，Azegami M，Sugiyama M，etal.Characteristics of signalling properties mediated by long－acting insulin analogue glargine and detemir in target cells of insulin［J］.Diabetes Res Clin Pract，2008，81：269－277.

［12］ Kurtzhals P，Schaffer L，Sorensen A，etal.Correlations of receptor binding and metabolic and mitogenic potencies of insulin analogs designed for clinical use［J］.Diabetes，2000，49：999－1005.