難治性顳葉癲癇海馬星形膠質細胞中P-gp、p53表達與凋亡探討

段寶奇，劉 憶，胡 靜，高覺民

(江蘇省中醫院神經外科1、血液凈化中心2，江蘇 南京 210029)

難治性顳葉癲癇易引起早逝、外傷、精神病、認知障礙等嚴重后果[1]，多需要手術切除海馬，雖然諸多學者對海馬神經元改變致耐藥難治等進行廣泛研究，但關于海馬星形膠質細胞在其中的作用研究較少。本文通過免疫組化、免疫印跡法(Western blot)、原位末端標記(TUNEL)方法檢測P-gp、p53和細胞凋亡在星形膠質細胞的表達，探討其在難治性顳葉癲癇患者中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 17例難治性顳葉癲癇手術患者為2005年4月至2011年8月在我科手術的患者，其中男性7例，女性10例，年齡8～36歲，平均23.5歲，病程3～32年，平均10.5年。所有患者均正規服用抗癲癇藥物治療兩年以上，仍不能控制發作，平均每個月發作>3次。術前患者均進行了長程視頻腦電圖檢測棘波定位于顳葉；頭部MR檢查符合海馬硬化診斷標準；癲癇血藥濃度檢測在有效濃度范圍；均在皮層和深部電極監測下行前顳葉切除術。對照組為手術內減壓治療嚴重顱腦外傷3例和半球腦梗塞2例，均無癲癇發作史。所有患者均有患者或家屬簽署手術同意書。

1.2 標本 手術切除的每例腦組織標本均留取部分放入液氮保存備用，其余予4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，切成6 μm厚的切片，備行免疫組化和凋亡檢測。

1.3 主要試劑 P-糖蛋白抗體購自Santa Cruz公司；p53抗體、β-action和二抗購自武漢博士德公司；原位末端標記檢測細胞凋亡(TUNEL)試劑盒由Roche公司提供；即用型快速免疫組化MaxVision試劑盒，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑等購自福州邁新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 采用即用型快速免疫組化MaxVision試劑盒。分別加入P-gp、p53一抗，37℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次，滴加MaxVision二抗，37℃或室溫孵育10～15 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染。P-gp在胞膜和胞漿、p53在胞核染成黃色或棕色為陽性。在高倍顯微鏡下隨機選取視野，計數100個細胞中的陽性細胞個數，重復5次，取其均值。

1.2.2 凋亡細胞檢測 使用TUNEL試劑盒進行檢測，按說明書操作，以細胞核染成紫褐色為陽性。在高倍顯微鏡下隨機選取視野，計數100個細胞中的陽性細胞個數，重復5次，取其均值。

1.2.3 免疫印跡法 取出液氮保存的腦組織標本，在冰浴下用玻璃研磨器磨碎，加入細胞裂解液裂解細胞1 h；4℃下12 000 r/min離心20 min，取上清后采用Bradford比色法進行蛋白定量。取等量的蛋白樣品，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉運于硝酸纖維素膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，洗膜后分別與一抗P-gp(1:500)、p53(1:200)及β-抗體(1:6000)孵育4℃過夜，次日TBST洗脫5 min共3次，加HRP標記的二抗(1:400)孵育2 h。加入增強化學發光劑中反應數分鐘，最后以高效顯影膠片曝光并沖洗膠片。Labworks軟件分析結果時以蛋白條帶作為內參照。計算P-gp、p53蛋白條帶及β白條帶與內參照蛋白條帶像素灰度的百分比值，作為蛋白表達的相對水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.0軟件進行統計學分析，所有的實驗結果以均數±標準差(±s)表示，兩組間的比較采用t檢驗，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P-gp免疫組化 對照組P-gp只在微血管內皮細胞膜表達，而實驗組微血管內皮細胞和部分星形膠質細胞膜都有表達(圖1)。

圖1 P-gp免疫組化(×200)

2.2 p53免疫組化 對照組未見明顯p53陽性細胞，實驗組有14例可見p53陽性細胞，主要為星形膠質細胞，少部分神經元細胞(圖2)。

圖2 p53免疫組化(×200)

2.3 TUNEL 對照組未見凋亡陽性細胞，實驗組可見凋亡陽性細胞，主要為星形膠質細胞，少數神經元細胞(圖3)。

圖3 TUNEL(×200)

2.4 Western blot分析 P-gp和p53在癲癇患者中表達較對照組明顯增高(圖4、圖5)。

圖4 Western blot分析

圖5 Western blot分析

2.5 統計學分析 顯微計數顯示實驗組P-gp、p53免疫組化和凋亡陽性細胞較對照組明顯增加；Western blot分析提示實驗組P-gp、P53較對照組表達明顯增加，結果見表1。

表1 兩組免疫組化(p53、P-gp)、TUNEL、Western blot結果(±s)

表1 兩組免疫組化(p53、P-gp)、TUNEL、Western blot結果(±s)

注：t檢驗，P<0.05。

組別對照組實驗組17例數5 P-gp 0 13.84±7.73 P53 0 10.47±7.52 TUNEL 0 5.82±3.41 P-gp 0.72±0.14 1.43±0.42 P53 0.37±0.16 1.26±0.37 Western blot

3 討論

顳葉癲癇多為難治性癲癇，即表現出對多種抗癲癇藥物耐藥，人們發現多藥轉運體與耐藥相關，其中又以P-gp的作用為著。P-gp是多耐藥基因編碼的170 kD膜蛋白，在正常腦組織中主要在微血管內皮細胞表達，可阻止內源性和外源性物質進入中樞神經系統，成為血腦屏障作用的一部分，許多抗癲癇藥物也是其作用底物而被排出細胞膜外。癲癇發作可以造成內皮細胞損傷，血腦屏障被破壞，進而構成第二道屏障的膠質細胞產生級聯反應，也高表達P-gp。從本組實驗我們發現：實驗組免疫印跡法顯示P-gp較對照組有更高的表達；而免疫組化顯示除血管內皮細胞外有部分星形膠質細胞P-gp陽性，對照組未見陽性P-gp膠質細胞。膠質細胞P-gp高表達，可進一步限制抗癲癇藥物作用于異常放電的神經元[2]，促成癲癇耐藥難治。

難治性顳葉癲癇多有海馬神經元丟失、凋亡及膠質細胞反應性增生，本組實驗我們也有相似發現。同時免疫組化和免疫印跡法發現實驗組膠質細胞較對照組有明顯的p53高表達，這與Engel等[3]、Xu等[3]報道結果一致。而TUNEL發現星形膠質細胞較神經元凋亡明顯，這可能是由于：(1)腦組織中膠質細胞為神經元細胞的20～50倍，而硬化海馬組織中神經元丟失較多，使神經元和膠質細胞比例進一步下降，導致實驗組可見的神經元細胞數量減少。(2)癲癇患者的硬化海馬組織中神經元細胞以壞死為主要方式，凋亡可能是次要原因[4]。(3)癲癇發作多伴有腦組織的缺氧，而在體條件下星形膠質細胞比神經元更易受損；且海馬區星形膠質細胞比神經元更易發生凋亡；同時反應性星形膠質細胞化后，星形膠質細胞更容易發生死亡[5]。結合本組實驗結果，我們認為調控細胞凋亡的p53在星形膠質細胞高表達，也支持星形膠質細胞較神經元細胞更易發生凋亡。

隨著分子生物學的研究深入，人們在癲癇研究中發現P-gp、p53與凋亡之間有密切關系。如Morrison等[6]發現敲除p53的小鼠可以減少癲癇發作導致的細胞凋亡，并認為缺少p53在癲癇發作中有減少凋亡作用，p53參與了凋亡的調控。而Engel等[3]發現在顳葉癲癇患者海馬組織內p53表達上升和凋亡表現，并認為癲癇后受損細胞可以通過p53途徑誘導凋亡。研究發現p53也參與了P-gp的調控[7]，如表達P-gp的MDR-1下游啟動子有p53的結合位點，從而調節P-gp表達；p53還可以與轉錄調節因子ETS-1協同作用或者通過對核因子R33等多種細胞因子做出反應而增加P-gp的表達，雖然其中可能有p53變異的結果，但野生型p53也同樣具有類似的作用。動物模型發現癲癇可以促使p53和P-gp的表達，同樣癲癇患者中P-gp表達明顯加強[2]。結合本組實驗結果，我們認為由于癲癇的反復發作，腦組織膠質細胞受到應激、缺氧等損傷信號的作用，p53水平首先增加，從而提高P-gp的表達，以抵抗損傷的影響，但是P-gp的增加卻導致了癲癇耐藥；當損傷刺激反復并達到細胞難以修復時，則p53誘導細胞凋亡，而星形膠質細胞凋亡，則其對神經細胞的保護、營養修復作用減弱，這都導致了難治性癲癇的形成。

本實驗把p53對P-gp和凋亡的作用聯系起來，可能反映了以p53為調控通路的癲癇動態變化，同時我們發現以上變化發生在膠質細胞，所以膠質細胞在癲癇的作用及是否可以通過調控膠質細胞功能協同治療癲癇值得深入研究。

[1] 練啟輝.妥泰治療難治性部分性癲癇臨床研究[J].海南醫學，2011,22(11):44-46.

[2] 許尚臣,龐 琦,董 勇,等.海馬硬化致耐藥性顳葉內側癲癇的耐藥基因蛋白表達及意義[J].立體定向和功能性神經外科雜志,2009,22(1):6-9.

[3] Engel T,Murphy BM,Schindler CK,et al.Elevated p53 and lower MDM2 expression in hippocampus from patients with intractable temporal lobe epilepsy[J].Epilepsy Research,2007,77:151-156.

[4] Xu S,Pang Q,Liu Y,et al.Neuronal apoptosis in the resected sclerotic hippocampus in patients with mesial temporal lobe epilepsy[J].Clin Neurosci,2007,14:835-840.

[5] 王 萍,王 偉,徐運蘭,等.大鼠腦缺血再灌注后神經元和星形膠質細胞凋亡的比較研究[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2006,16:113-118.

[6] Morrison RS,Agrawal ML,Kight K,et al.Relationship between expression of multiple drug resistance proteins and p53 tumor suppressor gene proteins in human brain astrocytes[J].Neurosci,2003,127:605-612.

[7] Damir Janigro.The cell cycle in the central nervous system[M].United States:Humana Press,2006:373-388.