山梨酸鉀的毒理學評價

曾 婷，謝逸欣，馬 麗

（廣州軍區(qū)疾病預防控制中心，廣東 廣州 510507）

山梨酸鹽是一種抗菌防腐劑，具有抗細菌和抗真菌的性質(zhì)，通常用于口服和局部用制劑中，特別是含有非表面活性劑的制劑中，常用濃度是0.1%～0.2%。一般認為它是相對無毒的食品添加劑，但是，也有一些關(guān)于山梨酸鹽不良反應的報道，包括皮膚刺激性、過敏性或超敏性反應，然而口服山梨酸鹽未見系統(tǒng)不良發(fā)應的報道[1]。為了探明其食用的安全性，現(xiàn)對其常用品種山梨酸鉀進行安全毒理學評價。

1 材料與方法

1.1 樣品 山梨酸鉀(河南浩鑫生物科技有限公司，純度>98%)，白色結(jié)晶性粉末，無異味，易吸濕。

1.2 實驗動物 健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重18～22 g；于2008年購入即用于本實驗，由四川省醫(yī)學實驗動物中心提供(川動管字第2008 09號)。實驗環(huán)境：溫度23℃～25℃，相對濕度65%～70%。

1.3 實驗方法 根據(jù)衛(wèi)生部2003年發(fā)布的《食品安全性毒理學評價程序》(GB15193)中要求的方法進行相關(guān)實驗[2]。實驗中以實際給藥量為依據(jù)，配制相應濃度的山梨酸鉀水溶液，即配即用。

1.3.1 急性毒性實驗 將昆明小鼠40只隨機分為對照組及受試組各20只，雌雄各半，分養(yǎng)在4個籠里。采用寇氏法測定LD50。實驗過程：實驗小鼠隔夜空腹，24 h內(nèi)口服給藥(灌胃)，給藥量為0.4 ml/20 g。三周內(nèi)連續(xù)觀察，記錄動物進食、一般活動(中毒表現(xiàn))、大小二便以及死亡情況[3]，并計算LD50。

1.3.2 骨髓細胞微核試驗 小鼠50只，隨機分為5組，雌雄各半。根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設3個劑量組，分別為高劑量組(1/2 LD50=650 mg/kg)、中劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、低劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)；并且設立溶劑對照組和陽性對照組共五個組別。陽性對照組在間隔24 h內(nèi)，用環(huán)磷酰胺40 mg/kg連續(xù)灌胃兩次，在最后一次給藥后的6 h，勁椎脫位處死小鼠，將股骨骨髓腔制成的細胞懸液涂片置于Giemsa應用液中染色，在油鏡下觀察。用雙盲法閱片，每只動物計數(shù)1 000個嗜多染紅細胞，觀察含有微核的嗜多染紅細胞數(shù)，微核率以千分率表示[4]。

1.3.3 小鼠精子畸形試驗 將雄性小鼠50只隨機分為五組，根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設3個劑量組：高劑量組(1/2 LD50=650 mg/kg)、中劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、低劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)；另設溶劑對照組和陽性對照組。陽性對照組以甲基磺酸甲酯(MMS)50 mg/kg體重灌胃。各組小鼠連續(xù)給藥5 d，于第一次給藥后的第35天處死，取出兩側(cè)附睪，常規(guī)制片，用伊紅染色1 h，在高倍鏡下檢查精子形態(tài)，計數(shù)結(jié)構(gòu)完整精子。每只動物觀察1 000個精子形態(tài)(無鉤、香蕉形、胖頭、無定性、尾折疊、雙頭、雙尾等)并計數(shù)[5]。

1.3.4 致畸試驗 選用健康、性成熟且未交配的雌性小鼠40只以及雄性小鼠20只，隨機分為四組，雌雄各半，根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設3個劑量組，分別為高劑量組(1/2 LD50=650 mg/kg)、中劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、低劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)和溶劑對照組。實驗小鼠按照雌雄動物1:1比例同籠后，每日早晨檢查陰栓(或陰道涂片)，查出陰栓(或精子)則認為該鼠已經(jīng)交配，當日作為受孕0 d。如果5 d內(nèi)未交配，則更換雄鼠。檢出的妊鼠隨機分組，并稱重和編號，在受孕的第7～16天，每天給予本品。分別于受孕的0 d、7 d、12 d、16 d、10 d稱重。每組實驗孕鼠于妊娠第20天勁椎脫位處死5只，剖腹取出子宮稱重，記錄并檢查吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數(shù)。活胎鼠出生24 h內(nèi)逐一記錄性別、體重、體長，對胎鼠進行體表檢查(頭部、軀干部、四肢)，觀察是否有異常。定時稱量體重，斷乳時處死解剖，檢查骨骼以及內(nèi)臟(頭部、胸部、腹部)有無畸形[6]。

1.3.5 30 d喂養(yǎng)試驗 小鼠80只隨機分成四組，每組20只，雌雄各半，根據(jù)本品LD50=1 300 mg/kg設3個劑量組，分別為高劑量組(1/4 LD50=325 mg/kg)、中劑量組(1/8 LD50=162.5 mg/kg)、低劑量組(1/12 LD50=108.3 mg/kg)和溶劑對照組。連續(xù)30 d，各劑量組按照相應劑量口服給藥(灌胃)，溶劑對照組給予蒸餾水。每周觀察并記錄小鼠的一般表現(xiàn)、行為、中毒表現(xiàn)和死亡情況。每周稱1次體重和食物攝入量。實驗至30 d時，眼眶取血后頸椎脫位處死。測定紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)等血液學指標以及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)等血液生化學指標；對肝、腎、脾、胃腸等重要臟器進行組織病理學檢查[7]。

1.4 統(tǒng)計學方法 本實驗中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5進行統(tǒng)計；計數(shù)資料數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布的比較采用t檢驗，非正態(tài)分布的比較采用卡方檢驗。計量資料采用配對t檢驗，以均數(shù)±標準差(±s)表示。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 急性毒性試驗 試驗期間，中、高劑量組部分小鼠出現(xiàn)了中毒癥狀，主要表現(xiàn)：反應遲鈍，行為呆滯，缺乏知覺，呼吸減弱，流涎流淚等，同時有2只小鼠死亡。經(jīng)查表得LD50=1 300 mg/kg，因此，本品屬于低毒級。

2.2 骨髓細胞微核試驗 根據(jù)試驗結(jié)果統(tǒng)計分析，各實驗組微核率均為1.8‰，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；和陽性對照組22.0‰比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，結(jié)果見表1。

表1 骨髓細胞微核試驗結(jié)果

2.3 小鼠精子畸形試驗 統(tǒng)計結(jié)果顯示，各劑量組小鼠精子畸形率分別為2.84%、2.88%、2.94%，與溶劑對照組2.58%比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；和陽性對照組98.36%比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，結(jié)果見表2。

表2 小鼠精子畸形試驗結(jié)果(只)

2.4 傳統(tǒng)致畸試驗 小鼠妊娠前后的一般情況良好，且藥物對其生殖能力并無明顯影響。孕鼠妊娠14 d處死后，各劑量組與溶劑對照組比較，在吸收胎、早死胎、晚死胎及活胎數(shù)方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。各劑量組胎鼠體重、體長增長速度均無異常，各劑量組與溶劑對照組比較差異也無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。肉眼檢查胎鼠體表、頭部、軀干部及四肢未見明顯異常和畸形。處死后，檢查枕骨、脊椎骨、骨盆等骨骼，未見明顯異常和畸形。檢查頭部、胸部、腹部的內(nèi)臟，在大小、形態(tài)等方面未見明顯異常和畸形。

表3 山梨酸鉀對胎仔影響試驗結(jié)果比較(只)

表4 山梨酸鉀對胎鼠出生后體重增長情況比較(±s)

表4 山梨酸鉀對胎鼠出生后體重增長情況比較(±s)

組別 動物數(shù)(只)出生時間(d)07低劑量組中劑量組高劑量組溶劑對照組劑量(mg/kg)162.5 325 650 0 5555 1.70±0.20 1.69±0.21 1.65±0.19 1.71±0.22 3.56±0.35 3.51±0.41 3.49±0.32 3.61±0.40 14 5.59±0.40 5.52±0.44 5.33±0.47 5.66±0.42 21 12.01±0.61 11.95±0.57 11.92±0.60 12.02±0.53

2.5 30 d喂養(yǎng)試驗

2.5.1 動物一般情況 實驗過程中無動物死亡，各組動物毛發(fā)正常，無異常行為表現(xiàn)。在體重和食物攝入量方面，各劑量組動物與溶劑對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5.2 血液常規(guī)檢查 本實驗中，各劑量組與溶劑對照組動物的RBC、WBC等血液學指標均在正常范圍內(nèi)，比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5.3 各實驗組動物血清生化指標 根據(jù)實驗結(jié)果，高劑量組與溶劑對照組動物的指標TC、TG比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表5。

表5 血液生化指標結(jié)果(±s)

表5 血液生化指標結(jié)果(±s)

注：實驗組與溶劑對照組比較，*P<0.01。

組別低劑量組中劑量組高劑量組溶劑對照組劑量(mg/kg)108.3 162.5 325 0動物數(shù)(只)20 20 20 20 ALT(U/L)48.6±4.1 49.2±4.1 51.5±4.3 45.8±3.6 BUN(mmol/L)8.37±0.86 8.37±0.79 10.68±1.01 7.56±0.81 GLU(mmol/L)5.26±0.43 5.37±0.45 5.89±0.59 4.98±0.39 TC(mmol/L)1.25±0.30 1.27±0.33 1.75±0.42*1.18±0.08血液生化指標TG(mmol/L)0.73±0.06 0.77±0.07 1.02±0.15*0.51±0.05

2.5.4 病理學檢查 在組織病理學檢查中，觀察各劑量組相對于溶劑對照組的動物臟器是否具有明顯改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外觀、大小等各方面，心、肝、脾、肺、腎、胃腸等重要臟器均正常，未見明顯的毒性病理改變。

3 討論

根據(jù)以上毒理學實驗結(jié)果，證實了山梨酸鉀對動物機體無毒害，加上其具有較廣的抗菌譜，對霉菌、酵母菌等均有抗菌性，是一種典型的酸性防腐劑，在人體正常的代謝下，大部分會代謝生成二氧化碳和水從人體排出。本實驗中通過對小鼠進行急性毒性實驗，得到其LD50=1 300 mg/kg，表示山梨酸鉀為低毒級物質(zhì)；通過骨髓細胞微核試驗，證實山梨酸鉀無致突變的作用；在小鼠精子畸形試驗中也證實了本品無遺傳毒性及潛在的致癌作用；通過傳統(tǒng)致畸試驗顯示本品無致畸作用；在急性毒性試驗的基礎上，通過30 d喂養(yǎng)試驗，對動物體重和食物攝取量的觀察，RBC、WBC等血液學指標以及ALT、BUN、GLU、TC、TG等血液生化學指標的分析，對肝、腎、脾、胃腸等重要臟器進行組織病理學檢查，進一步證明山梨酸鉀對動物機體無毒害。

本實驗中，血清生化指標中膽固醇有隨試驗劑量增高而增高的趨勢，但無劑量反應關(guān)系，而且山梨酸鉀濃度過大，實際用量將稀釋許多倍，但為安全起見，建議進一步做大鼠90 d喂養(yǎng)等試驗，以長期對山梨酸鹽進行更深入細致的研究。

毒理學安全評價是衡量食品添加劑毒性大小的重要依據(jù)，各種添加劑能否使用以及使用范圍和最大使用量應嚴格按照《食品添加劑管理辦法》的規(guī)定操作，以保證其在安全范圍內(nèi)使用。中國衛(wèi)生部發(fā)布的《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中有規(guī)定，山梨酸鉀在不同食物中的使用量是在0.075～2.01 g/kg的范圍內(nèi)，這個限量相對于日本的《食品衛(wèi)生法》和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織制定的《國際食品法典委員會(CAC)標準》中的規(guī)定限量遠遠偏低。當然，各國制定的標準可能與每個國家的飲食、環(huán)境、生活方式等的不同有很大的關(guān)系。

綜上所述，可以斷定山梨酸鉀是安全的，可作為食品、藥品、飼料等領(lǐng)域的防腐劑，商業(yè)前景十分廣泛。

[1] 鄭俊民.藥用輔料手冊[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005:581-583.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學評價-食品安全性毒理學評價程序.中華人民共和國國家標準,GB15193.1-2003.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學評價-急性毒性實驗.中華人民共和國國家標準,GB15193.3-2003.

[4] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學評價-骨髓細胞微核試驗.中華人民共和國國家標準,GB15193.5-2003.

[5] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學評價-小鼠精子畸形試驗.中華人民共和國國家標準,GB15193.7-2003.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學評價-致畸試驗.中華人民共和國國家標準,GB15193.14-2003.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全性毒性學評價-90天和30天喂養(yǎng)試驗.中華人民共和國國家標準,GB15193.13-2003.