芝麻粕降解菌株的篩選誘變及鑒定

婁立起，田璨熙，李 磊，譚 軍，吳永堯

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

芝麻粕是芝麻取油后的副產品，我國作為芝麻生產大國，僅芝麻餅粕的年產量就在50萬t以上，資源十分豐富[1]。芝麻粕中，蛋白質平均含量在40%～46%，氨基酸的含量也十分豐富[2-4]，營養價值高[5-7]，尤其是幾種主要必需氨基酸如蛋氨酸、蘇氨酸、精氨酸、色氨酸含量均高于其他餅粕[2]。目前對油料蛋白的利用研究主要集中在豆粕、油菜籽粕[8]和面籽粕，對芝麻粕蛋白的利用[9-12]研究較少。芝麻粕降解菌可利用芝麻粕作有機肥料，通過對芝麻粕的降解使得餅粕中的大分子蛋白降解成小分子肽段或氨基酸。筆者從自然界廣泛篩選芝麻粕降解菌，并進行誘變和發掘條件優化，旨在為芝麻粕降解菌在農業上的生產利用提供理論和試驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 土壤和水樣。采集時間為2011年4月，土壤、水樣分別采集自湖南農業大學水稻基地、食堂下水道，采集后的樣品裝入三角瓶中。

1.1.2 培養基 初篩培養基：芝麻粕50 g/L，121℃滅菌25 min；酪素平板培養基：干酪素1 g/L，溶解，加水定容至100 mL并調pH值為7，瓊脂2%；種子培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，自然pH值；搖瓶培養基：芝麻粕50 g/L，121℃滅菌25 min。LB肉湯培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 （1）初篩方法：將采集的水樣（95∶5） 和土壤 （1∶1） 分別加入初篩培養基中，在37℃、180 r/min條件下于搖床中培養5 d。將發酵液用無菌水梯度稀釋，滴加0.1 mL涂布于酪素平板培養基篩選，取透明圈大的菌株接種于斜面，進行復篩。（2）復篩方法：將斜面保存的初篩菌株接入種子培養基中，在37℃、180 r/min條件下于搖床中培養24 h，取5 mL接種于搖瓶培養基中，同樣條件下培養48 h[13]。

1.2.2 酶活力及生物量的測定 （1）蛋白酶活力的測定：采用福林酚法[14]，酶活力定義為1 mL液體酶在40℃和pH值為7的條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位，以U/mL表示。（2）生物量的測定：采用平板菌落計數法。

1.2.3 菌株的鑒定 取復篩后的菌株接種于LB肉湯培養基中，37℃培養24 h，提取DNA作為模板進行PCR擴增。16S rRNA基因PCR擴增的2個引物分別為27F （正向引物）：5′—AGAGTTTGATC（C/A）TG2GCTCAG—3′；1492R（反向引物）：5′—GGTTACCTTGTTACGACTT—3′。PCR擴增產物經切膠回收后，由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行基因序列測定。

將上述菌株的16S rRNA基因序列進行Blast比對，分析序列同源性，使用ClustalX1.83軟件與GenBank數據庫中獲得的細菌16S rRNA序列進行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用鄰接法（Neighbor joining method）構建系統發育樹。

1.2.4 菌株的誘變 用10 mL無菌生理鹽水洗脫出發菌株斜面，打散菌體后稀釋至102個/mL菌懸液，在紫外燈下進行誘變，15 W、254 nm紫外燈30 cm 照射。設置照射時間分別為 0、20、40、60、80、120、140 s。吸取照射后菌懸液0.1 mL涂布于酪素平板37℃避光培養48 h。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

菌種初篩后得到146株可降解芝麻粕的菌株，通過透明圈大小的比較選取30株進行復篩，結果如表1所示。這些菌株的生物量維持在2.5×108～12.1×108cfu/mL，酶活力在 97～355 U/mL，其中菌株7的酶活力達352.436 U/mL，因此選用菌株7進行下一步研究。

表1 初篩菌種發酵后的酶活及生物量

2.2 菌株的鑒定

復篩出的菌株7的16S rRNA基因序列長度為1 447 bp，將該菌株的16S rRNA基因序列進行NCBI的Blast檢索系統同源性檢索，結果表明，該菌株與芽孢菌屬等細菌的16S rRNA基因序列自然聚類。在檢索出的芽孢桿菌序列中，該菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同源性達99%。根據該菌16S rRNA基因序列測定與系統發育學分析的結果，判斷將其為枯草芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌。

2.3 菌株的誘變

圖1 LQ16S rRNA基因進化樹

將出發菌株7在紫外照射不同時間，結果如圖1所示，隨著照射時間的延長，致死率逐漸增大，40 s時致死率為86.6%，選取40 s為誘變劑量。菌株經誘變后，從平板上挑選26株進行搖瓶培養，部分菌株蛋白酶發酵后結果如圖2所示，菌株4的酶活力明顯高于其他菌株，酶活力達587.3 U/mL。選取保存該菌株，并命名為LQ。

圖2 紫外誘變致死曲線

圖3 誘變后菌株酶活力

3 討論

菌株LQ經過系統發育學分析確定為解淀粉芽孢桿菌，它是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌。在其自身的生長過程中可以產生一系列的代謝產物，如葡萄糖苷酶、淀粉酶以及蛋白酶等，有些代謝產物使解淀粉芽孢桿菌能夠具有廣泛抑制真菌和細菌的活性[15]。以解淀粉芽孢桿菌為出發菌株降解芝麻粕粗蛋白的應用尚未見詳細報道，菌株LQ對芝麻粕中粗蛋白有較好的降解作用，拓寬了解淀粉芽孢桿菌的應用范圍。

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