枯草芽孢桿菌木聚糖酶Xyn B在畢赤酵母中的表達

廣西人口和計劃生育研究中心 莫 毅

廣西畜牧研究所 梁方方＊ 賴志強 盧玉發 廖玉英 何仁春 黃麗霞

華南農業大學動物科學學院 楊 琳

木聚糖酶能夠降解飼料中的木聚糖，提高飼料利用率，降低畜禽腸道內飼料的黏度，從而提高飼料的有效能值和改善動物消化道的內環境，促進動物生長（張曉暉等，2007）。但由于從自然環境中篩選所獲得的木聚糖酶產生菌存在產量低，木聚糖酶不易分離純化、穩定性差、不同來源的酶適應性不同等不足，在一定程度上限制了木聚糖酶的動物飼料添加劑中的實際應用 （阮同琦等，2008；陳叢瑾等，2007）。

畢赤酵母 （Pichia pastoris）是一種高效的真核表達系統，該系統不僅克服了原核表達系統產物不易分離純化和不能保持重組蛋白活性等缺點，且可對翻譯后的蛋白進行適度糖基化修飾、折疊、加工，使生產的蛋白具有天然的高級結構及生物學活性（Anjali等，2009；Su 等，2007）。 此外，畢赤酵母具有遺傳穩定性強，外源蛋白的表達基因操作簡單、外源蛋白能正確加工與修飾、表達量高、易大量發酵培養、內源性蛋白分泌少和易純化等優點，使得畢赤酵母成為目前應用較廣的分泌型真核表達系統（Cereghino和 Cregg，2000）。本文通過將編碼枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis strain GD3b）木聚糖酶（Xyn B）基因，克隆到 pPICZa A載體中，構建分泌型畢赤酵母表達載體pPICZa-Xyn B，重組質粒經線性化轉入畢赤酵母X-33，經篩選獲得可分泌表達Xyn B重組蛋白的畢赤酵母工程菌 X-33/Xyn B（莫毅等，2011）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株 大腸桿菌株E.coli.DH5a，畢赤酵母菌株X-33和重組質粒pUC-Xyn B由本實驗室保存；質粒pPICZa A購于Invitrogen公司。

1.1.2 試劑 T4DNA連接酶、DNA分子質量標準、限制性內切酶Sac I、EcoR I和Xba I均購于TaKaRa大連寶生物技術有限公司；Ni-NTA磁珠購于法瑪西亞公司；Zeocin、YPD、BMGY、BMMY培養基見Invitrogen公司的畢赤酵母操作手冊（Invitrogen，2008）；其他常規試劑為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pPICZa-Xyn B的構建 將pUC-Xyn B重組質粒中的Xyn B基因片段和pPICZa A載體使用EcoR I和Xba I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生物有限公司）純化后，按照Xyn B：pPICZa A數量比為3∶1取樣混合，通過T4DNA連接酶4℃連接過夜；次日，取5 μL連接混合液轉化感受態E.coli.DH5a，經復蘇后，在 LB（Zeocin 25 μg/mL）平板上涂板，過夜培養。陽性轉化子質粒進行EcoR I和Xba I雙酶切鑒定。鑒定正確后，菌液委托上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.2 重組畢赤酵母的構建及篩選 以LiCl法將Sac I線性化的重組質粒pPICZa-Xyn B轉化畢赤酵母宿主菌X-33，轉化物涂布于YPD（Zeocin 100 μg/mL）平板，30 ℃培養 3 d。 將平板上的轉化子分別于新的YPD（Zeocin 100 μg/mL）平板上劃線接種，30℃培養3～5 d以獲得較多的轉化菌。

以pPCIZa A表達載體AOX引物AOX F：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'，AOX R：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'，挑取 7 株轉化菌裂解為模版，進行PCR擴增（莫毅等，2011）。退火溫度為58℃，擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 Xyn B重組蛋白表達檢測 經PCR鑒定后，挑取菌落水解圈最大的陽性轉化子X-33/Xyn B轉接于搖瓶進行擴培。取擴培后的菌株接種于10 mL BMGY培養基中，30℃，250 r/min振蕩培養20 h。離心收集菌體，再將其懸浮于250 mL BMMY培養基中，繼續30℃，250 r/min振蕩培養，每隔24 h向BMMY培養基中補加甲醇至終濃度為1.0%進行誘導表達，約5 d取2.5 mL上清液與10 μL Ni-NTA磁珠混合，旋轉振蕩過夜；次日，離心收集Ni-NTA磁珠，并用PBS緩沖液洗滌3次，加入蛋白上樣緩沖液制樣進行SDSPAGE電泳檢測。

2 結果分析

2.1 重組質粒pPICZa-Xyn B的構建 由圖1可見，重組質粒pPICZa-Xyn B經雙酶切鑒定得到2條特異性條帶，分別與目的基因片段（642 bp）和線性pPICZa A載體（3600 bp）大小一致，表明Xyn B已定向插入表達載體pPICZa A中。重組質粒同時送上海生工生物工程有限公司測序，結果表明，插入的基因片段全長642 bp，讀碼框正確。

圖1 重組質粒pPICZa-Xyn B雙酶切鑒定

2.2 重組畢赤酵母X-33/Xyn B的篩選 7個重組畢赤酵母菌基因組使用AOX引物，經PCR鑒定結果見圖2。由圖2可見，7個重組菌均擴增出一特異性條帶，與目的基因片段 （639 bp）+pPICZa A AOX測序區域（580 bp）大小一致，結果說明，所挑選的7個重組畢赤酵母菌基因組中已整合了Xyn B基因。

2.3 Xyn B重組蛋白表達檢測 由圖3可見，重組菌誘導表達得到明顯的蛋白表達帶，與重組Xyn B融合蛋白35.1 kDa大小相符（Xyn B基因的理論分子質量23.3 kDa+9.3 kDa的a信號肽+2.5 kDa的C末端標簽），說明SDS-PAGE電泳已檢測到了Xyn B的融合蛋白表達；此外，在45 kDa后還有一條較明顯的條帶，分子質量大于Xyn B融合蛋白的理論值，此結果與韓雙艷等（2009）研究報道的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis B2）木聚糖酶Xyn重組菌誘導表達的重組蛋白分子質量大于理論分子質量的結果相似。可能與木聚糖酶蛋白序列存在6個N糖基化位點，2個O糖基化位點，重組蛋白表達過程中部分蛋白糖基化而引起的分子量偏大。而其他的雜帶有可能是菌體本身的表達蛋白，分子量小，且量不多，可直接通過選擇合適孔徑的超濾管進行篩選，便于目的蛋白的純化。

3 結論

分泌型酵母表達載體pPICZa A具有信號肽基因a-factor和甲醇誘導型強啟動子AOX。afactor信號肽可幫助外源蛋白順利的分泌到細胞外，方便了產物的檢測和純化；甲醇氧化酶啟動子是強誘導型啟動子，利于通過甲醇的誘導強化外源基因表達。 本研究選用pPICZa A作為表達載體，成功構建了重組質粒pPICZa-Xyn B，篩選到能夠成功表達Xyn B重組融合蛋白的畢赤酵母X-33/Xyn B，為進一步研究重組木聚糖酶的酶學特性，開發優質的飼料添加劑奠定基礎。

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