單胚胎RT-qPCR對豬體細胞核移植囊胚全能性的分析

吉林大學畜牧獸醫學院 謝萬華 陳仙菊 姚朝剛 韓 陽 逄大欣 唐曉春

體細胞核移植技術現已成功應用到牛、小鼠、豬、兔和狗等多種哺乳動物，其在生物醫學和生命科學研究等領域具有較大價值。然而，體細胞核移植技術存在克隆效率低下，大量的克隆動物出生后就死亡，或者各種器官發育不正常等問題。有研究認為，克隆動物發育不正常主要是供體細胞核重編程不完全導致的 （Hochedlinger和Jaenisch，2003）。處于分化狀態的供體細胞核需要通過卵母細胞中一些重編程因子的作用將其轉化為胚胎的去分化狀態才能繼續發育。目前關于重編程的機制了解甚少。研究發現，重編程因子是通過調控一些關鍵基因的表達從而維持正常的發育（Tamashiro等，2002）。因此，通過對胚胎發育中關鍵基因的研究，可以揭示發育的機制。然而，胚胎間的發育是相對獨立的過程，即使在同一母體內，受精卵的發育也不是同步進行的，各個胚胎中基因的表達存在很大差異。而傳統的基因表達研究方法需要從大量的樣品中獲取模板，極大的限制了其對微量樣品的研究，如胚胎的發育。因此，有必要從單胚胎水平來研究胚胎的發育（Stahlberg等，2011；Wang 和 Bodovitz，2010）。 本試驗從單胚胎水平，分析了豬體細胞核移植囊胚和體內囊胚中全能性基因（Oct4、Nanog和 Sox2）的表達量，同時還比較了這兩種囊胚的質量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬卵巢和動物 豬卵巢采自長春市綠園區屠宰場。試驗動物為懷孕33～35 d的長白母豬和人工授精5 d的長白母豬，均來自吉林大學種豬場。

1.1.2 主要試劑 Nonidet P-40購于Amresco公司；SUPERase-In RNA酶抑制劑購于Applied Biosystems公司；SuperScriptⅢ 反轉錄酶、5×First-Strand Buffer、DTT均購于 Invitrogen公司；RiboLock RNA酶抑制劑、去RNA酶水均購于Fermentas公司；T4噬菌體基因32編碼蛋白購于New England Biolabs公司；SYBR GreenⅠ熒光PCR試劑盒購于杭州博日科技有限公司。

1.1.3 主要器材 體視顯微鏡、顯微操作儀、倒置熒光顯微鏡購于日本Nikon公司；超凈工作臺、4℃恒溫離心機、CO2培養箱購于美國Thermo公司；BTX 2000電細胞融合儀購于美國BTX公司。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的采集與體外成熟 從屠宰場采集豬卵巢，放于有青霉素和鏈霉素的生理鹽水中，以35℃恒溫運回實驗室。用12號無菌注射器抽取直徑為3～6 mm卵泡中的卵母細胞。在體視顯微鏡下迅速挑取包含有3層以上卵丘細胞、致密、胞質均勻的卵母細胞，用TL-HEPES-PVA液洗滌3次，再用豬卵母細胞體外成熟培養液洗滌3次后放于成熟液中，于38.5℃，5%CO2的飽和濕度的培養箱中培養（Lai和 Prather，2003）。

1.2.2 供體細胞的制備 通過手術獲取懷孕33～35 d的長白豬胎兒，用剪刀、鑷子去胎兒頭、尾、四肢和內臟，其余部分用剪刀剪碎，然后用膠原蛋白酶消化組織。用含20%FBS的DMEM培養液原代培養。0.25%胰蛋白酶消化成單細胞后，用含10%FBS的DMEM傳代培養。核移植使用前，將細胞用0.25%胰蛋白酶消化成單個細胞懸液。

1.2.3 重構胚的構建 將體外成熟42～44 h的卵母細胞用透明質酸酶處理，去除顆粒細胞。在體式顯微鏡下挑取排除第一極體的成熟卵母細胞，用操作液洗滌 3次（Lai和 Prather，2003）。 核移植在含7.5 μg/mL細胞松弛素B的操作液中進行。將卵母細胞第一極體調到5點鐘方向，用內徑為20 μm的注射針從卵母細胞3點鐘方向刺入，吸出第一極體及其附近的胞質，從而去核；吸取一個成纖維細胞從原來的口將其注入透明帶與卵母細胞膜間的卵周隙中。

1.2.4 重構胚的融合與激活 重構胚的融合和激活在BTX 2000電細胞融合儀作用下完成。將重構胚胎放于盛有融合液的電極槽的兩電極之間（Lai和 Prather，2003）。 然后進行 1.2 kV/cm，30 μs，2次直流電脈沖使供體細胞與卵母細胞融合，同時激活卵母細胞。激活的重構用PZM-3洗滌3次，放于PZM-3中，于38.5℃，5%CO2的飽和濕度的培養箱中培養。

1.2.5 體內囊胚的獲取 對發情的長白豬進行人工授精。授精后第5天，通過手術的方法，用含10%FBS的PBS從母豬子宮中沖取囊胚，并且保存于38.5℃條件下，盡快運回實驗室，用PZM-3洗滌3次，保存于38.5℃，5%CO2的飽和濕度的培養箱中，備用（Lai和 Prather，2003）。

1.2.6 囊胚質量檢測 高倍鏡下觀察體內囊胚和克隆囊胚形態學上的差異。囊胚細胞數目的檢測：用4%多聚甲醛固定囊胚，然后用Hoechest 33342定位細胞核，在紫外激發下用熒光顯微鏡觀測并記錄這兩種囊胚的細胞數目。

1.2.7 單囊胚cDNA的制備 參考單細胞RNASeq方法，建立單胚胎cDNA制備的方法。囊胚用臺氏液去掉透明帶，用口吸管將去透明帶的囊胚放于含0.1 mg/mL BSA的PBS液滴中洗滌3次（Tang 等，2010、2009）。 再將囊胚轉移入 22.25 μL的細胞裂解液中，細胞裂解液在使用前配制，體系為：5 μL 5× First-Strand Buffer，1.125 μL 10%Nonidet P-40，1.125 μL DTT （0.1 mol/L），0.225 μL SUPERase-In RNA 酶抑制劑，0.225 μL RiboLockTM RNA酶抑制劑，0.625 μL引物 Oligo（dT）（0.5 μmol/L），0.45 μL dNTP，13.225 μL 去RNA酶水。引物Oligo（dT）序列為：5’-ATATGGATCCGGCGCGCCGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。然后將裂解的細胞樣品于70℃水浴處理90 s，立刻放于冰上冰浴，使RNA從細胞中釋放出來。向樣品中加入2.25 μL的反轉錄酶混合體系（1.65 μL SuperScripⅢ 反轉錄酶，0.25 μL RiboLockTM RNA酶抑制劑，0.35 μL T4噬菌體基因32編碼蛋白）。50℃水浴反應30 min，70℃酶滅活處理15 min。將合成的cDNA保存于-20℃。

1.2.8 qPCR引物的設計及其擴增效率的鑒定qPCR引物采用Beacon Designer 7軟件設計。引物序列分別為，β-actin上游引物：GAACCCCAAAGCCAACCGT，下游引物 ：CCTCGTAGATGGGCACCGT，退火溫度為60℃，擴增產物大小為 173 bp；Oct4上游引物：AAGCAGTGACTATTCGCAAC，下游引物：CAGGGTGGTGAAGTGAGG，退火溫度為60℃，擴增產物大小為136 bp；Nanog 上游引物：TCCTCTTCCTTCCTCCAT，下游引物：TCCTTCTCTGTGCTCTTC，退火溫度為54℃，擴增產物大小為 108 bp；Sox2上游引物：CGCAGACCTACATGAACG， 下游引物：TCGGACTTGACCACTGAG，退火溫度為60℃，擴增產物大小為103 bp。用制作標準曲線的方法檢測引物的擴增效率。以制得的8 μL體內囊胚cDNA為初始模板，2倍梯度稀釋制備5～6個標準品，然后用這些標準品進行實時熒光定量PCR反應。從儀器自動獲取標準曲線和擴增效率。實時熒光定量 PCR 反應體系：12.5 μL 2×SYBR Green master mix，8 μL cDNA，1 μL 上下游引物 （各 0.5 μL），3.35 μL ddH2O，0.15 μL Taq DNA 聚合酶；94 ℃ 2 min，94 ℃ 10 s，退火 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環。

1.2.9 實時熒光定量檢測囊胚的全能性基因 分別以制備的5個體細胞核移植囊胚和5個體內囊胚的cDNA為模板，用iQ 5實時定量PCR檢測系統以 SYBR Green I為熒光染料檢測 Oct4、Nanog和Sox2的表達量。實時熒光定量PCR反應體 系 ：12.5 μL 2×SYBR Green master mix，2 μL cDNA，1 μL 上下游引 物 （各 0.5 μL），3.35 μL ddH2O，0.15 μL Taq DNA 聚合酶；94 ℃ 2 min，94℃ 10 s，退火 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環。 采用相對定量方案，以2-△△Ct方法分析數據 （Livak和Schmittgen，2001）。β-actin 作為參照基因，以體內1號囊胚為參照組。用SPSS16.0軟件分析數據的差異性，當P值小于0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 豬體細胞核移植囊胚質量的檢測 在高倍顯微鏡下，對豬體細胞核移植囊胚和體內囊胚細胞形態進行比較。在Hoechest 33342染料作用下，記錄了10個克隆囊胚和10個體內囊胚的細胞數目，分別為110±10.3和54±12.6。體細胞核移植囊胚中細胞總數顯著降低（P<0.05）。相比體內囊胚，體細胞核移植囊胚的細胞形態差，無明顯的內細胞團集落。

2.2 引物擴增效率 由圖1可見，引物β-actin、Oct4、Sox2和Nanog的擴增效率 （E值）分別為99.5%、104.5%、98.3%和96.1%，PCR擴增效率為 95%～105%，相關系數（r2）>0.98，可用于實時熒光定量檢測對應基因的表達。

2.3 豬體細胞核移植囊胚和體內囊胚全能性基因表達水平的比較 由圖2可見，Nanog和Sox2的表達量在5個體細胞核移植囊胚中均顯著低于體內囊胚；除了體內2號囊胚的Oct4表達量和4個核移植囊胚差異不顯著外，其余4個體內囊胚中的Oct4表達量均顯著高于5個體細胞核移植囊胚（P<0.05）。

3 討論

本試驗中，通過與體內囊胚比較，發現體細胞核移植囊胚的細胞不但形態差，而且囊胚中細胞的數目顯著降低。研究表明，細胞的增殖和分化與細胞凋亡相關（Exley等，1999），并且體細胞核移植囊胚的細胞凋亡率顯著高于體外受精囊胚和體內囊胚（Yu等，2007）。因此，本試驗中體外培養的核移植囊胚細胞數的減少可能是由細胞凋亡導致。

為了正常的發育，在體細胞核移植中，已經分化的供體必須通過重編程的過程適當的激活某些基因和關閉某些分化基因的表達以支持胚胎的發育 （Humpherys等，2002）。在早期胚胎發育過程中，Oct4、Nanog和Sox2對維持胚胎的全能性是必須的（Bortvin 等，2003；Boiani等，2002）。 有報道證實，敲除Oct4的小鼠囊胚的內細胞團缺失全能性。Oct4與Sox2相互作用可以與Nanog基因啟動子結合，從而調控Nanog的表達，三者通過網絡調控細胞的全能性 （Rodda等，2005；Nichols等，1998）。本試驗通過建立單胚胎RT-qPCR技術檢測豬體細胞核移植囊胚和體內囊胚中全能性基因（Oct4、Nanog和Sox2）的表達量。與體內囊胚相比，體細胞核移植囊胚中全能性基因的表達量普遍下降。分析認為，豬體細胞核移植囊胚質量差與其全能性基因（Oct4、Nanog和Sox2）表達量低相關。

[1]Boiani M，Eckardt S，Scholer H R，et al.Oct4 distribution and level in mouse clones：consequences for pluripotency[J].Genes Dev，2002，16：1209～1219.

[2]Bortvin A，Eggan K，Skaletsky H，et al.Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryos cloned from somatic nuclei[J].Development，2003，130：1673 ～ 1680.

[3]Exley G E，Tang C，McElhinny A S，et al.Expression of caspase and BCL-2 apoptotic family members in mouse preimplantation embryos[J].Biol Reprod，1999，61：231 ～ 239.

[4]Hochedlinger K，Jaenisch R.Nuclear transplantation，embryonic stem cells，and the potential for cell therapy[J].N Engl J Med，2003，349：275 ～ 286.

[5]Humpherys D，Eggan K，Akutsu H，et al.Abnormal gene expression in cloned mice derived from embryonic stem cell and cumulus cell nuclei[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99：12889 ～ 12894.

[6]Lai L，Prather R S.Production of cloned pigs by using somatic cells as donors[J].Cloning Stem Cells，2003，5：233 ～ 241.

[7]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T））Method[J].Methods，2001，25：402 ～ 408.

[8]Nichols J，Zevnik B，Anastassiadis K，et al.Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4[J].Cell，1998，95：379 ～ 391.

[9]Rodda D J，Chew J L，Lim L H，et al.Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2[J].J Biol Chem，2005，280：24731 ～ 24737.

[10]Stahlberg A，Kubista M，Aman P.Single-cell gene-expression profiling and its potential diagnostic applications[J].Expert Rev Mol Diagn，2011，11：735～740.

[11]Tamashiro K L，Wakayama T，Akutsu H，et al.Cloned mice have an obese phenotype not transmitted to their offspring[J].Nat Med，2002，8：262 ～267.

[12]Tang F，Barbacioru C，Nordman E，et al.RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell[J].Nat Protoc，2010，5：516 ～ 535.

[13]Tang F，Barbacioru C，Wang Y，et al.mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell[J].Nat Methods，2009，6：377 ～ 382.

[14]Wang D，Bodovitz S.Single cell analysis：the new frontier in'omics'[J].Trends Biotechnol，2010，28：281 ～ 290.

[15]Yu Y，Ding C，Wang E，et al.Piezo-assisted nuclear transfer affects cloning efficiency and may cause apoptosis[J].Reproduction，2007，133：947 ～954.