孕早期甲氧滴滴涕染毒對孕鼠胎盤組織ERα 基因表達的影響

王曉蓉，苑洪菲，王黎娜，于 波

環境污染物是造成不孕、流產和胎兒畸形的主要原因之一。研究發現，早期胚胎發育階段對環境污染物更加敏感［1］，明確其致病機制，尋找有效的監測和預防手段一直為臨床所關注。甲氧滴滴涕作為一種替代滴滴涕的有機氯殺蟲劑目前在許多國家得到廣泛應用，近年研究發現MXC 具有多方面的毒性作用，尤其以生殖毒性引人注目［2］。研究表明，MXC 是一種環境內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，具有雌激素樣作用，胚胎和胎兒是MXC 最敏感的靶器官之一，MXC 體內羥基代謝產物的雌激素樣作用強于MXC。MXC 的毒性作用機制與ERα 密切相關，其代謝產物是ERα 的激動劑，可以通過ERα 介導產生相應的生物學效應，同時可以改變不同組織ERα 的表達水平［3，4］。然而，有關MXC 影響早期胚胎發育的研究報道較少，筆者通過構建孕鼠早期胚胎發育MXC 染毒模型，檢測MXC 染毒對孕鼠胎盤組織ERα 表達的影響，探討MXC 影響雌性生殖健康和胚胎發育的毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠60 只(雌性40 只，雄性20 只)，8 周齡，平均體重(28.12 ±3.3)g，由第四軍醫大學實驗動物中心提供，自由飲食、飲水，清潔級飼養。

1.2 試劑及儀器 MXC(批號:49054，純度:99%，Sigma 公司)，芝麻油(批號:S3547，Sigma－Aldrich公司)、雌二醇(批號:10006315，純度＞98%，Cayman Chemical 公司)、兔抗鼠ERα 單克隆IgG 抗體(Santa Cruz 公司)、Trizol 總RNA 抽提試劑盒(Invitrogen 公司)、RT 試劑盒(Invitrogen 公司)、DAB 顯色試劑盒(武漢Boster 生物工程公司);ABI7300 Real－Time PCR 檢測儀(ABI 公司)、LX70 倒置顯微鏡(Olympus 公司)、凝膠成像系統(UVP 公司)。

1.3 構建孕鼠MXC 染毒模型 孕鼠隨機分組，每組10 只，分別為MXC 染毒組、正常對照組與陽性對照組。依據文獻［5］，妊娠0.5 ～7.5 d，MXC 染毒組孕鼠皮下注射MXC 166.67mg/(kg·d)，正常對照組孕鼠皮下注射芝麻油，陽性對照組孕鼠皮下注射雌二醇(1.0 μg)。

1.4 RT－PCR 檢測胎盤組織中ERα mRNA 表達 各組孕鼠剖宮產后收集胎盤組織，置入經DEPC 處理的EP 管中，于－80 ℃保存待測。依據GenBank 核酸序列數據庫設計ERα 引物，由上海生物工程技術公司合成。上游引物:5'－TGT ACC TGC CTA GCA ACA GT－3'，下游引物:5'－GCC ACG TAT CTA AGT CAC CT－3'(450 bp)，內參照β－actin 上游引物:5'－GGT GGG AAT GGG TCA GAA GG－3'，下游引物:5'－CCA AGA AGG AAG GCT GGA AAA－3'(671 bp)。應用Trizol 方法提取胎盤總RNA，ERα cDNA特異性擴增與定量分析應用RT－PCR 技術。擴增條件:93 ℃1 min，56 ℃30 s，72 ℃1 min，進行1 個循環;93 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃1 min，進行30 個循環;72 ℃延伸8 min。取擴增產物10 ml，5%瓊脂糖凝膠電泳，UVP 凝膠成像系統進行檢測，計算各條帶PCR 產物凝膠電泳的光密度與相應β－actin 條帶光密度的比值表示其相對表達水平。

1.5 免疫組化法檢測胎盤組織中ERα 表達水平 孕鼠胎盤組織樣本以4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脫水，石蠟包埋，采用冰凍切片機制備厚度為5 μm的冷凍切片，丙酮－20 ℃固定后置于－80 ℃保存。取上述組織切片，依據免疫組化方法進行檢測。

1.6 統計學處理 采用SPSS13.0 統計軟件進行t檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎盤組織中ERα mRNA 表達 ERα 在各組胎盤組織均有表達，與正常對照組ERα mRNA 的相對表達量(0.49 ± 0.09)相比，MXC 染毒組ERα mRNA 的相對表達量(0.68 ± 0.11)明顯增高，差異有統計學意義(P ＜0.05);與陽性對照組ERα mRNA 的相對表達量(0.60 ± 0.10)相比，MXC 染毒組ERα mRNA 的相對表達量差異無統計學意義(P ＞0.05)。

2.2 免疫組化結果 正常對照組、MXC 染毒組與陽性對照組孕鼠胎盤絨毛滋養層細胞可見ERα 陽性表達，ERα 為胞核、胞漿陽性染色。采用Motic Images Advanced 3.2 (Motic China Group Co，LTD)圖像分析系統，每張切片隨機選擇3 個視野(×200倍)，測量平均陽性面積(μm2)與平均光密度(OD)值，兩者的乘積為免疫組化陽性指數，與正常對照組相比，MXC 染毒組孕鼠免疫組化陽性指數顯著增加(P ＜0.05，圖1)。

圖1 孕鼠胎盤ERα(免疫組化染色，×200)

3 討論

妊娠期胎盤雌激素的合成對胚胎的發育和妊娠的維持具有重要作用，此外雌激素與妊娠期的各個生理過程包括受精卵著床，以及分娩過程的調節密切相關。雌激素的生理學效應主要通過ERα 介導，研究發現卵裂細胞ERα 在孕鼠胚胎植入與發育期均有表達［6］。長期接觸MXC 可以導致生育能力明顯下降，胚胎發育早期階段對MXC 非常敏感，筆者前期實驗結果證實，早期持久性暴露MXC，孕鼠子代體重明顯減輕，胎鼠數明顯減少，子代出生后發育率明顯降低［5］。本研究發現，ERα mRNA 在MXC染毒孕鼠胎盤組織中的表達明顯增高，提示MXC 主要是以內源性雌激素樣方式作用于胎盤ERα。

MXC 可以通過與ERα 的相互作用影響胚胎早期發育并間接影響胎盤環境而產生長期毒性效應。MXC 與ERα 結合后，可以減少內源性雌激素與ERα 的結合，使其不能形成ERα 二聚體，影響與DNA 啟動子的雌激素反應元件結合，干擾調節靶基因轉錄，從而不能產生任何生物學效應，抑制小鼠植入前的胚胎發育，增加胚胎功能異常情況的發生比率，導致胚泡凋亡的高發生率，這可能是MXC 影響胚胎發育的重要作用機制之一［7，8］。目前研究發現，EDCs 還可以通過神經內分泌系統激活ERα 傳導通路［9］，因此對于MXC 影響胚胎發育和雌性生殖健康的毒性作用機制還需要進一步深入研究。

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