雄激素對前列腺癌細胞系泌乳素相關蛋白表達的影響*

崔書霞 郝志梅 郭志義 郝小惠 王素云 田 煒

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性生殖系統常見的惡性腫瘤，近年來隨著社會的老齡化和飲食習慣的西方化，PCa的發病率顯著增高[1]。目前普遍認為PCa為雄激素依賴性腫瘤，其發生與雄激素的刺激有關，雄激素受體（adrogen receptor，AR）在介導雄激素生物學效應上發揮著重要作用[2]。泌乳素相關蛋白（prolactin inducible protein，PIP）是一種15～17 ku的糖蛋白[3]，廣泛存在于精液、唾液、乳汁等體液中，并發揮著多種生物學作用[4]。PIP可作為一種腫瘤標志物被用來診斷乳腺來源的轉移癌[5]。最近研究發現，前列腺上皮細胞也能產生PIP，在前列腺癌中PIP有過度表達，并與前列腺特異抗原（PSA）存在共表達[6-7]。本研究探討PIP在前列腺癌細胞系中的表達情況，以及雄激素對其表達的影響，為進一步探討前列腺癌的發病機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌細胞系LNCaP、PC-3、DU145及人乳腺癌細胞系T47D均購自中國科學院細胞庫。兔抗人GCDFP-15（PIP）多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，鼠源GAPDH多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG及辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG購自中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 于含10%胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素100 U/mL， 鏈霉素 100 mg/L） 的 RPMI1640 （LNCaP、PC-3、DU145）或 DMEM（T47D）培養基中，置于 37 ℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養。細胞生長狀態良好，達到對數生長期時，將細胞按1×104/mL接種于培養瓶或6孔板內，孵箱孵育24 h后待用。

1.2.2 處理及分組 各培養細胞系分為空白對照組、不同濃度及不同時間處理組，不同濃度處理組應用（0.1、1、10、100 nmol/L） 雙 氫 睪 酮 （Dihydrotestosterone，DHT） 或 睪 酮（Testosterone，T）分別對各細胞系進行處理，不同時間處理組為應用10 nmol/L DHT或T處理6、24和48 h。

1.2.3 引物設計 通過NCBI基因庫獲得各目標基因序列，使用Primer Premier 5.0引物設計軟件 （Premier公司，加拿大）設計引物，由Invitrogen公司合成，設 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）為內參，各引物序列見表1。

Table 1 Primer sequences of PIP,AR and GAPDH genes表 1 PIP、AR和GAPDH基因特異性引物序列

1.2.4 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR） 取各組培養細胞，用Trizol抽提法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA純度，-70℃凍存待用。用Oligo（dT）、隨機引物、逆轉錄酶（Takara）等進行逆轉錄反應合成cDNA。使用各基因特異性引物，應用RT-PCR二步法試劑盒（Takara公司Ver2.1）進行PCR擴增，擴增產物應用1.5%瓊脂糖凝膠在100 V電壓下電泳確認。

1.2.5 實時熒光定量PCR 將1.2.4中逆轉錄反應合成的cDNA用各目標基因的特異性引物，使用Rotor-Gene Multiplex RT-PCR Kit（Qiagen）試劑盒，Rotor-Gene 3000 定量PCR儀（Corbett Robotics公司，澳大利亞）對各基因進行實時熒光定量PCR反應，反應條件為94℃15 s,56℃25 s,72℃20 s，40個循環。所獲得的PCR產物應用瓊脂糖凝膠電泳技術確認，同時使用各待測基因分別制作標準曲線，對所獲得的定量數據應用標準曲線法進行相對定量分析，使用GAPDH作為管家基因，實驗至少重復3次。

1.2.6 蛋白提取 將處于對數生長期且狀態良好的各組細胞，用 10 g/L的 NP40細胞裂解液（10 g/L NP40，pH 7.4 Tris堿 50 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，1 g/L SDS，5 g/L 脫氧 膽酸鹽，200 mg/L苯甲基磺酰氟，50 mg/L抑肽酶）裂解細胞，冰上震蕩裂解30 min，4℃12 000 r/min離心10 min。將離心后的上清分裝至0.5 mL Ep管中，BCA蛋白濃度測定試劑盒 （碧云天生物技術研究所）定量，-80℃保存待用。

1.2.7 Western blot 按照每孔 20 μg蛋白量上樣，SDSPAGE 100 V電壓電泳，8 mA/cm2電流半干轉印2 h將蛋白轉至PVDF膜上，5 g/L脫脂奶粉封閉2 h后，加入GCDFP-15（PIP）或GAPDH抗體工作液，4℃孵育過夜，TBST充分洗膜后加入辣根過氧化酶標記二抗室溫孵育2 h，BeyoECL Plus（碧云天生物技術研究所）化學發光顯色。

1.3 統計學方法 應用SPSS 16.0統計軟件進行統計分析，計量數據用均數±標準差±s）表示，組間比較應用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各細胞系PIP的表達 在LNCaP及T47D細胞中有PIP mRNA及PIP蛋白的表達，但LNCaP細胞中的PIP表達量低于T47D細胞；而在PC-3及DU145細胞中無PIP mRNA和PIP蛋白的表達，見圖1、2。在LNCaP與T47D中有AR mRNA表達，且表達量相近，而在PC-3與DU145中AR表達較少或無AR表達，見圖1。經實時熒光定量PCR確認LNCaP細胞中的PIP表達量約為T47D細胞的1/600。

Figure 1 PIP and AR mRNA expressions in four cell lines圖1 PIP及AR mRNA在4種細胞系中的表達

Figure 2 PIP expression in four cell lines by Western blot analysis圖2 PIP蛋白在4種細胞系中的表達

2.2 雄激素對LNCaP及T47D中PIP mRNA表達的影響 PIP mRNA的表達隨DHT或T濃度增加而增加，且DHT或T濃度達到10 nmol/L時PIP mRNA的表達量最大，與對照組（0 nmol/L）相比差異有統計學意義（P<0.01），見表2。經10 nmol/L DHT或T處理后24 h內LNCaP細胞中PIP mRNA的表達隨時間的延長而增加，于24 h時達到最大峰值，與對照組（0 h）相比差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

Table 2 PIP mRNA expressions of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表2 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響 （PIP/GAPDH±s）

Table 2 PIP mRNA expressions of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表2 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響 （PIP/GAPDH±s）

*P<0.05，**P<0.01；t值為各濃度組與0 nmol/L組比較，表4同

濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.242 1.033±0.176 2.391±0.084 3.338±0.024 1.734±0.008 t -0.146 15.036**15.732**3.062*T 1.000±0.242 1.020±0.036 2.557±0.031 3.496±0.366 1.636±0.012 t -0.148 9.884*10.479**4.387*LNCaP n濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.065 0.957±0.079 2.153±0.182 3.411±0.073 1.707±0.185 t -0.653 9.861*30.506**5.637*T 1.000±0.065 0.843±0.117 1.997±0.142 3.837±0.186 2.302±0.279 t -1.562 19.118**39.709**6.723*T47D n

Table 3 PIP mRNA levels of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表3 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

Table 3 PIP mRNA levels of LNCaP and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表3 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中PIP mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

*P<0.05；t值為各時點組與0 h組比較，表5同

時間（h）062 4 48 5555 DHT 1.000±0.348 1.465±0.435 3.487±0.047 2.516±0.429 t -1.031 13.516*3.507 T 1.000±0.348 1.745±0.581 3.303±0.278 2.319±0.398 t -1.475 7.503*3.220 LNCaP n 5555 DHT 1.000±0.621 1.650±0.346 3.411±0.073 2.303±0.096 t -1.226 6.036*3.730 T 1.000±0.621 1.064±0.213 3.670±0.164 2.033±0.167 t -0.256 6.369*2.600 T47D n時間（h）062 4 48

2.3 雄激素對LNCaP及T47D中AR mRNA表達的影響 對LNCaP及T47D細胞給予不同濃度或不同時間DHT或T處理，AR mRNA的表達差異均無統計學意義（均 P>0.05），見表 4、5。

Table 4 AR mRNA levels of LNcap and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表4 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響 （PIP/GAPDHs）

Table 4 AR mRNA levels of LNcap and T47D cell lines stimulated by different concentrations of DHT or T表4 不同濃度DHT或T對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響 （PIP/GAPDHs）

均P>0.05

濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.594 0.969±0.204 0.732±0.221 0.586±0.553 0.432±0.402 t -0.085 1.073 1.113 1.024 T 1.000±0.594 1.094±0.217 0.989±0.817 0.900±0.260 0.722±0.308 t -0.202 0.014 0.219 1.478 LNCaP n濃度（nmol/L）0 0.1 1 10 100 55555 DHT 1.000±0.318 0.815±0.127 0.807±0.126 0.580±0.012 0.696±0.109 t -1.080 0.965 2.381 1.236 T 1.000±0.318 0.895±0.125 0.774±0.287 0.785±0.087 0.752±0.229 t -0.672 0.443 0.358 0.513 T47D n

Table 5 AR mRNA level of LNcap and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表5 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

Table 5 AR mRNA level of LNcap and T47D cell lines stimulated by different times of 10 nmol/L DHT or T表5 10 nmol/L DHT或T處理不同時間對LNCaP及T47D細胞系中AR mRNA表達的影響（PIP/GAPDHs）

均P>0.05

時間（h）062 4 48 5555 DHT 1.000±0.710 0.976±0.751 0.492±0.464 0.493±0.244 t -0.050 0.901 0.929 T 1.000±0.710 1.079±0.695 0.755±0.218 0.300±0.147 t -0.987 0.457 1.423 LNCaP n 5555 DHT 1.000±0.083 0.949±0.062 0.780±0.012 1.136±0.271 t -0.614 4.042 1.246 T 1.000±0.083 0.785±0.228 0.785±0.087 1.227±0.181 t -1.205 3.698 1.636 T47D n時間（h）062 4 48

3 討論

PIP雖是一種小分子糖蛋白，但卻在腫瘤，尤其在乳腺癌和前列腺癌的增生和轉移過程起作用，在免疫反應、抗菌、受精及細胞凋亡等方面也具有重要作用[4]，并且PIP在乳腺癌中的過表達和癌的預后有關[7]。前期研究中已經證實PIP在正常前列腺組織中有表達，而且在前列腺癌中過表達[6]。本研究結果顯示PIP在雄激素依賴性PCa細胞LNCaP中表達，進一步證實了PIP與PCa發生發展有關。

體外培養前列腺癌細胞發現，雄激素對其生長有雙相作用，一定濃度范圍的雄激素刺激前列腺癌細胞（如LNCaP）的生長，過大劑量雄激素則抑制其生長，而過低濃度的雄激素則對癌細胞的生長沒有促進作用[8]。研究表明，在乳腺癌細胞系T47D中PIP的過表達受雄激素調節[9]。本研究結果顯示，PIP的表達隨雄激素的濃度增加而增加，當雄激素超過一定濃度時反而不能使PIP過度表達，說明PIP與LNCaP細胞的生長進程密切相關。結果還顯示，PIP在雄激素依賴性PCa細胞LNCaP中表達，而在雄激素非依賴性PCa細胞PC-3和DU145中不表達，更加證實了PIP的表達受到雄激素的調控，并且提示雄激素依賴性PCa與雄激素非依賴性PCa的發生發展機制有所不同，PIP或許可以成為一種鑒別手段應用于臨床。

研究認為，PIP基因上存在雄激素受體反應元件（androgen responsive element，ARE），而 AR 正是通過ARE作用于相關靶基因，從而介導產生雄激素生物學效應的[10]。當AR與雄激素配基結合后，AR構象發生改變形成同型二聚體并發生核轉位反應，由胞漿轉移至核內，識別并特異結合ARE，募集調節因子形成多蛋白復合體，該蛋白復合體與轉錄因子和基礎轉錄裝置相互作用從而調節基因轉錄[11]。目前研究認為，PCa與AR基因突變、擴增和表達缺失有關[12]。本研究結果顯示，AR的表達并未隨雄激素濃度及時間而增加，說明雄激素并非通過使AR增加來調控PIP的表達，或許是通過AR基因突變增加了其與雄激素及ARE的反應性，從而使PIP表達增多。

綜上所述，PIP在雄激素依賴性前列腺癌細胞（LNCaP）及雄激素非依賴性前列腺癌細胞（PC-3、DU145）中的表達有差異，PIP的表達受到雄激素的調控作用，但雄激素的這一作用并非通過AR表達的增加來實現。PIP或許在前列腺癌發生發展進程中，以及鑒別前列腺癌是否具有雄激素依賴性方面有一定作用。

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