慢性飲酒對大鼠肺組織中TIMP-1表達的影響*

王 星 吳 琦 于洪志 杜鐘珍

自20世紀80年代起我國酒類消費急劇增加，城市居民成人飲酒率達38.8%～59.0%，飲酒相關問題已嚴重影響我國人民的身心健康，全球近4%的死亡與乙醇有關[1]。有研究表明，乙醇與急性肺損傷、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等多種肺病有關[2]。乙醇可以引起肝、腎等臟器纖維化。本研究旨在通過觀察慢性攝入乙醇大鼠的肺組織改變，以探討乙醇和肺纖維化之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠20只，160～200 g，購自中國協和醫科大學放射科研究所，飼養于天津醫科大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑 根據文獻[3]方法自行配制Lieber-Decarli乙醇飼料（Lieber-Decarli Rat Ethanol Diet）和 Lieber-Decarli對照飼料，該配方飼料含熱量4 185.85 J/mL。其中乙醇飼料熱量：35%來自脂肪，11%碳水化合物，18%蛋白，36%乙醇；對照飼料熱量：35%來自脂肪，47%碳水化合物，18%蛋白。大鼠基質金屬蛋白酶抑制劑（TIMP）-1酶聯免疫分析試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。Masson三色染液購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 動物分組、模型的建立及標本處理 將20只大鼠按體質量編號，采用隨機數字表法分成乙醇組和對照組，每組10只。對照組每日給定量Lieber-Decarli對照飼料單籠喂養；乙醇組每日給定量Lieher-Decarli乙醇飼料單籠喂養，不再提供飲水。16周后，將大鼠稱質量后經2%水合氯醛（50 mg/kg）腹腔內注射麻醉，采用腹主動脈放血處死動物。沿胸骨中線打開胸腔，完整分離氣管和肺組織。取右肺下葉放入10%福爾馬林溶液內固定，行HE染色、Masson染色；右肺上葉、中葉先于液氮中保存之后一起轉存于-70℃低溫冰箱，制作組織勻漿測羥脯氨酸（HYP）、谷胱甘肽（GSH）和TIMP-1含量。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 Masson染色評定肺組織纖維化程度 用Olympus BX41光學顯微鏡，在100倍下隨機取10個視野進行觀察，按照Szapiel法[4]肺泡炎和肺纖維化的評分標準，計算各視野的分值，取其平均值作為該樣本的肺泡炎和肺纖維化評估分級。

1.4.2 GSH、HYP和TIMP-1含量檢測 比色法計算大鼠肺組織中GSH和HYP的含量，通過ELISA法檢測TIMP-1含量。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.5 統計學方法 采用SPSS 15.0統計軟件包。計量資料采用±s表示，2組間均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 造模前2組大鼠體質量差異無統計學意義（P>0.05），造模結束時，對照組大鼠體質量高于乙醇組（P<0.05），整個造模過程中2組大鼠總進食量（每日進食量×喂養總天數）差異無統計學意義（P<0.05），見表1。整個實驗過程中對照組大鼠精神狀態好，食欲佳，鼻尖干燥，皮毛有光澤，有溏便。乙醇組大鼠出現精神萎靡，活動減少，反應遲鈍，易激惹，鼻尖濕紅，毛色灰暗甚至脫落，稀便等表現。

Table 1 Changes of total food intake and body weight in two groups表1 2組大鼠總進食量和體質量變化±s）

Table 1 Changes of total food intake and body weight in two groups表1 2組大鼠總進食量和體質量變化±s）

**P<0.01

對照組乙醇組t 10 10造模前體質量（g）179.1±10.3 175.3±7.5 0.813造模結束時體質量（g）260.2±4.5 180.7±6.9 7.087**總進食量（mL）2 870±113 2 749±64 1.753組別 n

2.2 肺組織病理學改變

2.2.1 HE染色鏡下觀察 乙醇組標本顯示部分肺組織結構破壞、肺泡腔萎陷，肺泡間隔增寬，伴少量淋巴細胞浸潤及肺泡Ⅱ型上皮細胞增生，終末細支氣管周圍已可見少量淋巴細胞浸潤，對照組顯示肺泡結構清晰，肺泡壁薄，肺泡腔及間質內未見炎性細胞浸潤，見圖 1、2。

Figure 1 The lung tissues of control group圖1 對照組肺組織（HE×100）

Figure 2 The lung tissues of alcohol group圖2 乙醇組肺組織（HE×100）

2.2.2 2組大鼠的肺泡炎和肺纖維化評分的結果 Masson染色觀察顯示乙醇組肺泡間隔中膠原纖維中度增多，融合成細帶狀；而對照組肺泡間隔偶有細絲狀膠原纖維，見圖3、4。 對照組與乙醇組肺泡炎評分及纖維化的比較，差異均有統計學意義（P<0.01），見表 2。

Figure 3 The lung tissues of control group圖3 對照組肺組織（Masson染色×400）

Figure 4 The lung tissues of alcohol group圖4 乙醇組肺組織（Masson染色×400）

2.3 2組肺組織勻漿中HYP、GSH和TIMP-1含量的比較 乙醇組肺組織勻漿HYP和TIMP-1含量高于對照組，GSH含量低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05 或 P<0.01），見表 2。

Table 2 Comparison of indexes between two groups表2 2組各檢測指標比較±s）

Table 2 Comparison of indexes between two groups表2 2組各檢測指標比較±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別對照組乙醇組t n 10 10肺泡炎（分）1.23±0.11 2.47±0.19 12.691**肺纖維化（分）1.29±0.16 2.39±0.22 10.869**HYP（mg/g）0.343±0.073 0.579±0.134 3.128*GSH（mg/g）0.301±0.076 0.067±0.037 2.742*TIMP-1（μg/L）1 107.04±236.73 1 921.42±331.82 4.29**

3 討論

肺纖維化是由于過多的成纖維細胞聚集和細胞外的基質成分如膠原蛋白沉積而導致正常的肺組織結構改變和功能喪失的一類疾病。雖然起因不同，但纖維化的發展與結局基本相似。研究表明，氧化應激在彌漫性肺疾病（尤其是肺纖維化）的發病中具有重要的作用，增加氧化劑的水平或者降低抗氧化能力能促進肺纖維化的進展，不同類型的氧化應激可能引起不同特征的彌漫性肺疾病[5]。肺泡上皮細胞襯液和Ⅱ型肺泡上皮細胞內的GSH是肺部主要的抗氧化物質。本研究發現，乙醇組肺組織內GSH含量要明顯低于對照組，表明慢性乙醇可以使肺內GSH產生減少，進而可能引起氧化/抗氧化失衡，造成肺損傷。同時病理結果顯示乙醇組大鼠肺組織結構破壞，肺泡間隔炎性細胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡間隔內膠原纖維沉積明顯增多，提示飲酒可以對大鼠肺組織造成損傷并引起肺間質改變和纖維化。

肺纖維化發病機制的共同特征可能是體內膠原代謝的失衡，即膠原合成超過破壞，或膠原合成增加或(和)膠原破壞減少而導致膠原過多地沉積在肺實質內。由于HYP為膠原纖維所特有，故可作為評價肺纖維化的指標。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的沉積是肺纖維化的主要特征，許多酶可以降解ECM成分中大分子蛋白質，其中基質金屬蛋白酶（MMPs）被認為是最重要的一類。ECM與MMPs之間的失衡或MMPs與TIMPs之間的失衡均可導致ECM的代謝失衡。因此，MMPs/TIMPs在肺損傷及肺纖維化過程中可能發揮了重要的作用[6]。TIMP-1幾乎能夠抑制所有已知MMPs的活性，從而在維持生理狀態下ECM的沉積、降解平衡中起關鍵作用。本實驗發現慢性飲酒大鼠的肺組織勻漿HYP和TIMP-1含量明顯高于對照組，提示高水平表達的TIMP-1可能抑制了MMPs的活性，使Ecm在肺損傷修復過程中合成增加，降解減少，膠原代謝紊亂，導致肺組織HYP含量增加，從而發生了纖維化改變。這也提示TIMP-1的增高可能是慢性飲酒大鼠肺間質膠原沉積的主要原因。

轉化生長因子（TGF）-β是肺、腎、肝及皮膚病理性纖維化增生中的關鍵因子，TGF-β1在肺成纖維細胞中誘導TIMP-1，引起不可逆的肺纖維化，常被稱為“纖維化損傷性修復”[7]。已有研究顯示，慢性飲酒大鼠肺組織中TGF-β1表達升高[8]。本研究顯示慢性飲酒大鼠肺組織中TIMP-1表達升高，提示二者在慢性飲酒導致肺間質改變中發揮重要作用，但二者之間的相互聯系以及更多的細胞因子在肺纖維化中的作用有待進一步研究。

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