來(lái)曲唑增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)乳腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用探討

唐東華 周壽紅 王成昆 劉紅光

1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院外護(hù)教研組，湖南衡陽(yáng)421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南衡陽(yáng)4210013.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，湖南衡陽(yáng) 421001

乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一，其治療方式為手術(shù)輔以化療、放療。化療是治療乳腺癌常用的非手術(shù)方法之一，但它有著嚴(yán)重副作用。因此，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的敏感性和特異性一直是研究焦點(diǎn)。來(lái)曲唑（Letrozol）是第三代非甾體類芳香化酶抑制劑，它能抑制組織中的芳香化酶活性，進(jìn)而阻止雄激素向雌激素轉(zhuǎn)化，降低血液中雌激素水平，抑制雌激素依賴性癌細(xì)胞生長(zhǎng)。來(lái)曲唑主要用于絕經(jīng)后晚期乳腺癌，多用于抗雌激素失敗后的二線治療。但是來(lái)曲唑與一線抗腫瘤藥針對(duì)乳腺癌的聯(lián)用尚未見報(bào)道。從2011年11月4日—12月20日，該研究擬采用Balb/c-nu移植瘤模型，評(píng)價(jià)來(lái)曲唑聯(lián)用環(huán)磷酰胺對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用并探討其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及藥品

Balb/c-nu雌性裸鼠40只，6周齡，體重18～20 g，購(gòu)于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株該研究所保存。來(lái)曲唑；環(huán)磷酰胺；兔抗人Aromatase、PI3K多克隆抗；免疫組化試劑盒（S-P法），DAB顯色劑。

1.2 建立動(dòng)物模型

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，匯合度80%～90%的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基吸棄，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2～3次，胰蛋白酶(0.25%)消化，收集細(xì)胞，再次用PBS洗滌，吹打混勻、計(jì)數(shù)；再以無(wú)血清RPMI-1640調(diào)整濃度，按每只裸鼠背部皮下接種細(xì)胞數(shù)1.0×107/0.2 mL細(xì)胞懸液注射于裸鼠背部皮下，5～7 d后觀察腫瘤移植成功率。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

取成瘤裸鼠35只，采用隨機(jī)和均衡原則分成7組 (每組5只)。用藥及劑量：①對(duì)照組，PBS0.2 mL；②CTX 低劑量組(1 mg/kg)；③CTX高劑量組(40 mg/kg)；④來(lái)曲唑低劑量組(1 mg/kg)；⑤來(lái)曲唑高劑量組(5 mg/kg)；⑥CTX低劑量組+來(lái)曲唑低劑量組；⑦CTX高劑量組+來(lái)曲唑低劑量組，各組均采用腹腔注射隔天給藥，共8次。末次給藥后48 h處死裸鼠，取移植瘤進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo)和方法

分別用游標(biāo)尺測(cè)量皮下移植瘤底部Y軸（L）和X軸（W）長(zhǎng)度，按公式[V=0.52×L×W2]計(jì)算腫瘤體積[1]。 瘤重抑制率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)]×100%。聯(lián)合用藥效果根據(jù)公式：Q=Ea+b/[Ea+(1-Ea)×Eb]計(jì)算出Q值來(lái)判斷，Ea和Eb分別為各藥單用時(shí)的抑制率，Ea+b為兩藥聯(lián)用的抑制率，當(dāng)Q值＞1.15時(shí)，說(shuō)明二藥合用有協(xié)同作用；當(dāng)Q值＞0.85且＜1.15時(shí)，說(shuō)明二藥聯(lián)用有相加作用；當(dāng)Q值＜0.85時(shí)，說(shuō)明兩藥聯(lián)用存在拮抗作用。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

腫瘤標(biāo)本行常規(guī)病理切片，免疫組化染色SP法檢測(cè)Aromatase、PI3K的表達(dá)，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判別標(biāo)準(zhǔn)：Aromatase以細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色，無(wú)明顯背景著色，間質(zhì)干凈為合格染色切片；PI3K主要分布于胞漿，結(jié)果判斷同Aromatase。40倍物鏡下觀察10個(gè)視野內(nèi)并進(jìn)行圖像采集，繼而采用Image Pro6.0軟件對(duì)圖形進(jìn)行半定量分析：測(cè)出圖像中呈棕黃色顆粒的面積和吸光度并計(jì)算出積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)，IOD值越高，說(shuō)明蛋白表達(dá)量越高。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料數(shù)據(jù)以S.D表示，采用SPSS15.0軟件，單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行樣本均數(shù)多組別比較。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠成瘤情況

自接種后7 d開始，瘤細(xì)胞接種部位皮下可見小結(jié)節(jié)，約5 mm×5 mm大小；至第10天，腫瘤約7 mm×7 mm大小。共有38只裸鼠成瘤，成瘤率為95%。

2.2 移植瘤的病理學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剝?nèi)∫浦擦觯總€(gè)瘤組織切取部分進(jìn)行常規(guī)病理切片，H.E染色。鏡下可見癌組織被纖維間質(zhì)分隔成大小不等的癌巢，可見腺腔、腺管樣結(jié)構(gòu)；癌細(xì)胞大小不等，呈圓形或橢圓形；核大，核仁明顯，可見病理性核分裂像，胞漿微嗜堿半透明。

2.3 各組裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況

各實(shí)驗(yàn)組瘤體積及瘤重明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，來(lái)曲唑低劑量組與CTX低劑量和CTX高劑量組兩個(gè)聯(lián)用組抑瘤作用進(jìn)一步增強(qiáng)，抑瘤率分別為60.9%，80.95%，兩種藥物合用顯示出明顯的協(xié)同作用，Q值分別為1.142和1.221。結(jié)果見圖1，表1。

圖1 裸鼠移植瘤體積生長(zhǎng)曲線

表1 各組移植瘤瘤重抑制率及Q值

2.4 各組裸鼠對(duì)化療的毒性反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)期間，CTX高劑量組小鼠逐漸出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、食量及體重下降等表現(xiàn)，其余各組裸鼠未見明顯不良反應(yīng)。

2.5 來(lái)曲唑、環(huán)磷酰胺對(duì)腫瘤細(xì)胞Aromatase、PI3K蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：與陰性對(duì)照組比較，Aromatase和PI3K表達(dá)在來(lái)曲唑組中均下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在聯(lián)合用藥組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2，圖2。

3 討論

乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤。在我國(guó)北京、上海、天津等大城市的統(tǒng)計(jì)顯示乳腺癌同樣是我國(guó)女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。烷化劑類藥物是乳腺癌化療方案中較常用藥物，環(huán)磷酰胺是乳腺癌聯(lián)合化療的一線用藥，但其毒副作用卻較為嚴(yán)重。近期研究表明來(lái)曲唑有可能增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[2-4]。該研究也發(fā)現(xiàn)：除來(lái)曲唑單用組外，各用藥組中移植瘤的生長(zhǎng)均被不同程度抑制，而聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤抑制作用更明顯 (P<0.01)。第⑥和⑦實(shí)驗(yàn)組Q值均＞1.15，說(shuō)明來(lái)曲唑?qū)Νh(huán)磷酰胺有確切增效作用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，環(huán)磷酰胺高劑量組裸鼠不良反應(yīng)嚴(yán)重，也與臨床患者的不良反應(yīng)相吻合，與大劑量用藥的毒副作用有關(guān)。而其余實(shí)驗(yàn)組裸鼠均未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，說(shuō)明來(lái)曲唑能有效增加環(huán)磷酰胺的藥效并降低其毒副作用。

表2 Aromatase和PI3K在移植瘤內(nèi)表達(dá)的積分光密度值（IOD）(S.D)

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Aromatase和PI3K的表達(dá) (S-P×400)

芳香化酶是屬于細(xì)胞色素P450超家族，是體內(nèi)合成雌激素的關(guān)鍵酶。它可脫去雄激素的19-甲基，芳構(gòu)A環(huán)而轉(zhuǎn)化成C18雌激素(雌酮和雌二醇)。來(lái)曲唑是第三代芳香化酶抑制劑，可有效抑制芳香化酶合成雌激素[5]。雌激素在體內(nèi)與雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)結(jié)合，發(fā)揮多效復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)。雌激素受體可位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。經(jīng)典的核受體位于細(xì)胞核，擴(kuò)散到細(xì)胞核的雌激素與其核受體結(jié)合后引發(fā)基因調(diào)控機(jī)制，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄。ER介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中PI3K/Akt對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和抑制凋亡有重要作用。PI3K活化信號(hào)有助于細(xì)胞增殖并能抑制凋亡，有助于腫瘤生長(zhǎng)。許多實(shí)體腫瘤中都發(fā)現(xiàn)PI3K的過(guò)表達(dá)，如肺癌[6]、鼻咽癌[7]、等前列腺癌[8]。抑制PI3K的表達(dá)同樣能增強(qiáng)MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)環(huán)磷酰胺的敏感性[9]，抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[10-11]。

該研究應(yīng)用免疫組化發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌裸鼠移植瘤中芳香化酶表達(dá)較高。在來(lái)曲唑組和聯(lián)合用藥組中，Aromatase及PI3K的表達(dá)均被不同程度抑制。兩種劑量來(lái)曲唑與低劑量環(huán)磷酰胺組聯(lián)用后，對(duì)移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用較單獨(dú)用藥組明顯增強(qiáng)。說(shuō)明來(lái)曲唑與環(huán)磷酰胺聯(lián)用具有協(xié)同增效作用，其機(jī)制可能是來(lái)曲唑通過(guò)抑制Aromatase與PI3K的表達(dá)，弱化腫瘤細(xì)胞增殖信號(hào)，從而增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對(duì)乳腺癌細(xì)胞的有效性，提示來(lái)曲唑有望成為一種乳腺癌化療增敏劑，但其對(duì)化療藥物的增敏機(jī)制仍有待深入探討。

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