來曲唑增強環磷酰胺對乳腺癌裸鼠移植瘤生長的抑制作用探討

唐東華 周壽紅 王成昆 劉紅光

1.湖南環境生物職業技術學院外護教研組，湖南衡陽421001;2.南華大學醫學院，湖南衡陽4210013.南華大學附屬第一醫院腫瘤外科，湖南衡陽 421001

乳腺癌是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一，其治療方式為手術輔以化療、放療。化療是治療乳腺癌常用的非手術方法之一，但它有著嚴重副作用。因此，提高腫瘤細胞對化療藥的敏感性和特異性一直是研究焦點。來曲唑（Letrozol）是第三代非甾體類芳香化酶抑制劑，它能抑制組織中的芳香化酶活性，進而阻止雄激素向雌激素轉化，降低血液中雌激素水平，抑制雌激素依賴性癌細胞生長。來曲唑主要用于絕經后晚期乳腺癌，多用于抗雌激素失敗后的二線治療。但是來曲唑與一線抗腫瘤藥針對乳腺癌的聯用尚未見報道。從2011年11月4日—12月20日，該研究擬采用Balb/c-nu移植瘤模型，評價來曲唑聯用環磷酰胺對乳腺癌MDA-MB-231細胞裸鼠移植瘤生長的作用并探討其機制。

1 資料與方法

1.1 細胞株實驗動物、試劑及藥品

Balb/c-nu雌性裸鼠40只，6周齡，體重18～20 g，購于中科院上海實驗動物中心，SPF級飼養環境由南華大學實驗動物部提供。人乳腺癌MDA-MB-231細胞株該研究所保存。來曲唑；環磷酰胺；兔抗人Aromatase、PI3K多克隆抗；免疫組化試劑盒（S-P法），DAB顯色劑。

1.2 建立動物模型

將處于對數生長期，匯合度80%～90%的MDA-MB-231乳腺癌細胞瓶內培養基吸棄，用PBS緩沖液洗滌細胞2～3次，胰蛋白酶(0.25%)消化，收集細胞，再次用PBS洗滌，吹打混勻、計數；再以無血清RPMI-1640調整濃度，按每只裸鼠背部皮下接種細胞數1.0×107/0.2 mL細胞懸液注射于裸鼠背部皮下，5～7 d后觀察腫瘤移植成功率。

1.3 實驗動物分組

取成瘤裸鼠35只，采用隨機和均衡原則分成7組 (每組5只)。用藥及劑量：①對照組，PBS0.2 mL；②CTX 低劑量組(1 mg/kg)；③CTX高劑量組(40 mg/kg)；④來曲唑低劑量組(1 mg/kg)；⑤來曲唑高劑量組(5 mg/kg)；⑥CTX低劑量組+來曲唑低劑量組；⑦CTX高劑量組+來曲唑低劑量組，各組均采用腹腔注射隔天給藥，共8次。末次給藥后48 h處死裸鼠，取移植瘤進行。

1.4 觀察指標和方法

分別用游標尺測量皮下移植瘤底部Y軸（L）和X軸（W）長度，按公式[V=0.52×L×W2]計算腫瘤體積[1]。 瘤重抑制率(%)=[1-(實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重)]×100%。聯合用藥效果根據公式：Q=Ea+b/[Ea+(1-Ea)×Eb]計算出Q值來判斷，Ea和Eb分別為各藥單用時的抑制率，Ea+b為兩藥聯用的抑制率，當Q值＞1.15時，說明二藥合用有協同作用；當Q值＞0.85且＜1.15時，說明二藥聯用有相加作用；當Q值＜0.85時，說明兩藥聯用存在拮抗作用。

1.5 免疫組織化學檢測

腫瘤標本行常規病理切片，免疫組化染色SP法檢測Aromatase、PI3K的表達，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。結果判別標準：Aromatase以細胞胞漿呈現棕黃色，無明顯背景著色，間質干凈為合格染色切片；PI3K主要分布于胞漿，結果判斷同Aromatase。40倍物鏡下觀察10個視野內并進行圖像采集，繼而采用Image Pro6.0軟件對圖形進行半定量分析：測出圖像中呈棕黃色顆粒的面積和吸光度并計算出積分光密度(Integrated Optical Density，IOD)，IOD值越高，說明蛋白表達量越高。

1.6 統計方法

計量資料數據以S.D表示，采用SPSS15.0軟件，單因素方差分析(One-way ANOVA)進行樣本均數多組別比較。

2 結果

2.1 裸鼠成瘤情況

自接種后7 d開始，瘤細胞接種部位皮下可見小結節，約5 mm×5 mm大小；至第10天，腫瘤約7 mm×7 mm大小。共有38只裸鼠成瘤，成瘤率為95%。

2.2 移植瘤的病理學觀察

實驗結束后剝取移植瘤，每個瘤組織切取部分進行常規病理切片，H.E染色。鏡下可見癌組織被纖維間質分隔成大小不等的癌巢，可見腺腔、腺管樣結構；癌細胞大小不等，呈圓形或橢圓形；核大，核仁明顯，可見病理性核分裂像，胞漿微嗜堿半透明。

2.3 各組裸鼠皮下移植瘤生長情況

各實驗組瘤體積及瘤重明顯低于對照組(P<0.01)，來曲唑低劑量組與CTX低劑量和CTX高劑量組兩個聯用組抑瘤作用進一步增強，抑瘤率分別為60.9%，80.95%，兩種藥物合用顯示出明顯的協同作用，Q值分別為1.142和1.221。結果見圖1，表1。

圖1 裸鼠移植瘤體積生長曲線

表1 各組移植瘤瘤重抑制率及Q值

2.4 各組裸鼠對化療的毒性反應

實驗期間，CTX高劑量組小鼠逐漸出現活動減少、精神萎靡、食量及體重下降等表現，其余各組裸鼠未見明顯不良反應。

2.5 來曲唑、環磷酰胺對腫瘤細胞Aromatase、PI3K蛋白表達的影響

免疫組織化學檢測結果：與陰性對照組比較，Aromatase和PI3K表達在來曲唑組中均下調，差異有統計學意義(P<0.05)，在聯合用藥組中差異有統計學意義(P<0.01)。見表2，圖2。

3 討論

乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤。在我國北京、上海、天津等大城市的統計顯示乳腺癌同樣是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發病率呈逐年上升趨勢。烷化劑類藥物是乳腺癌化療方案中較常用藥物，環磷酰胺是乳腺癌聯合化療的一線用藥，但其毒副作用卻較為嚴重。近期研究表明來曲唑有可能增強化療藥物對腫瘤細胞的抑制作用[2-4]。該研究也發現：除來曲唑單用組外，各用藥組中移植瘤的生長均被不同程度抑制，而聯合用藥對腫瘤抑制作用更明顯 (P<0.01)。第⑥和⑦實驗組Q值均＞1.15，說明來曲唑對環磷酰胺有確切增效作用。在實驗過程中，環磷酰胺高劑量組裸鼠不良反應嚴重，也與臨床患者的不良反應相吻合，與大劑量用藥的毒副作用有關。而其余實驗組裸鼠均未出現明顯不良反應，說明來曲唑能有效增加環磷酰胺的藥效并降低其毒副作用。

表2 Aromatase和PI3K在移植瘤內表達的積分光密度值（IOD）(S.D)

圖2 免疫組織化學法檢測Aromatase和PI3K的表達 (S-P×400)

芳香化酶是屬于細胞色素P450超家族，是體內合成雌激素的關鍵酶。它可脫去雄激素的19-甲基，芳構A環而轉化成C18雌激素(雌酮和雌二醇)。來曲唑是第三代芳香化酶抑制劑，可有效抑制芳香化酶合成雌激素[5]。雌激素在體內與雌激素受體(Estrogen Receptor,ER)結合，發揮多效復雜的生物學效應。雌激素受體可位于細胞膜、細胞質或細胞核。經典的核受體位于細胞核，擴散到細胞核的雌激素與其核受體結合后引發基因調控機制，調節下游基因的轉錄。ER介導的信號轉導途徑包括PI3K/Akt信號轉導途徑和MAPK/ERK信號轉導途徑，其中PI3K/Akt對于腫瘤細胞生長增殖和抑制凋亡有重要作用。PI3K活化信號有助于細胞增殖并能抑制凋亡，有助于腫瘤生長。許多實體腫瘤中都發現PI3K的過表達，如肺癌[6]、鼻咽癌[7]、等前列腺癌[8]。抑制PI3K的表達同樣能增強MDA-MB-231細胞對環磷酰胺的敏感性[9]，抑制MDA-MB-231細胞的增殖并誘導其凋亡[10-11]。

該研究應用免疫組化發現在人乳腺癌裸鼠移植瘤中芳香化酶表達較高。在來曲唑組和聯合用藥組中，Aromatase及PI3K的表達均被不同程度抑制。兩種劑量來曲唑與低劑量環磷酰胺組聯用后，對移植瘤的生長抑制作用較單獨用藥組明顯增強。說明來曲唑與環磷酰胺聯用具有協同增效作用，其機制可能是來曲唑通過抑制Aromatase與PI3K的表達，弱化腫瘤細胞增殖信號，從而增強環磷酰胺對乳腺癌細胞的有效性，提示來曲唑有望成為一種乳腺癌化療增敏劑，但其對化療藥物的增敏機制仍有待深入探討。

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