腦膠質瘤組織中的細胞周期分析與意義*

劉馨蓮 殷 舞 李 欣

細胞分子生物學研究認為，腫瘤的本質在于細胞周期的調控紊亂，細胞呈現失控性生長和凋亡減少[1]。細胞周期是細胞生命活動的基本過程，正常細胞周期是指正常連續分裂的細胞從前一次有絲分裂結束到下一次有絲分裂完成所經歷的連續動態過程。主要分為4期：G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）和M期（有絲分裂期）。隨著正常細胞周期和腫瘤細胞周期的深入研究，許多學者認為細胞生長周期的失調與多種腫瘤的發生、發展有關，且對腫瘤的惡性生物學行為及腫瘤的預后有重要意義[2-4]。本研究主要探討細胞周期蛋白（Cyclin）D1、Cyclin A、Cyclin B1和核分裂特異性抗體（PHH3），分別代表G1期、S期、G2期和M期在腦膠質瘤中的表達特征和規律，以期為腦膠質瘤的早期診斷和預后評價提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2003年9月—2008年2月廣西壯族自治區人民醫院手術切除的腦膠質瘤組織標本59例。其中男31例，女28例，年齡4~73歲，平均（46.2±19.6）歲。根據2000年WHO神經系統腫瘤分類標準：Ⅰ級10例，Ⅱ級15例，Ⅲ級15例，Ⅳ級19例。另外選取同時在該院接受因顱腦損傷行內減壓術患者的正常腦組織37例為對照，全部標本均經10%甲醛固定，普通石蠟包埋，4 μm連續切片。

1.2 試劑 鼠抗人Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1單克隆抗體購自BD Pharmingen公司，兔抗人PHH3多克隆抗體購自Upstate Group LLC公司，S-P試劑盒和SAP-9100試劑盒購自北京中杉生物技術開發公司，DAB試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。

1.3 方法 免疫組化染色采用S-P法。石蠟切片脫蠟水化后，微波抗原修復，過氧化酶阻斷劑滅活內源性過氧化物酶活性，羊血清工作液封閉，滴加一抗4℃過夜，滴加生物素標記的二抗，滴加鏈親和素—過氧化物酶溶液。PHH3標記用堅固紅顯色，其余標記均用DAB顯色，蘇木精復染。用已知陽性組織切片為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。1.4 結果判斷 Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1蛋白染色均以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性細胞，PHH3染色以細胞核出現紅色顆粒為陽性細胞。計算Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1及PHH3的標記指數（LI）：選取10個陽性細胞最密集、背景最清晰區域，每個區域高倍視野（×400）下計算100個細胞中的陽性細胞數，計算1 000個腫瘤細胞中陽性細胞所占的百分比，取其平均值即為LI。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行分析，所有數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

37例正常腦組織均無Cyclin D1、Cyclin A、Cy?clin B1和PHH3的表達。在59例人腦膠質瘤標本中，Cyclin D1陽性表達41例（69.5%），陽性染色信號出現于胞核，見圖1。Cyclin A陽性表達41例（69.5%），陽性染色信號出現于胞核，見圖2。Cy?clin B1陽性表達37例（62.7%），陽性染色信號出現于胞核，見圖3。PHH3陽性表達50例（84.7%），陽性染色信號出現于胞核，見圖4。4級腦膠質瘤的Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3的陽性LI比較差異均有統計學意義（P<0.01），見表1。

Figure 1 The positive expression of protein Cyclin D1 in gradeⅣ glioma(SP×400)圖1 Cyclin D1蛋白在Ⅳ級膠質瘤細胞核中的陽性表達（SP×400）

Figure 2 The positive expression of protein Cyclin A in gradeⅢ glioma(SP×400)圖2 Cyclin A蛋白在Ⅲ級膠質瘤細胞核中的陽性表達（SP×400）

Figure 3 The positive expression of protein Cyclin B1 in gradeⅣ glioma(SP×400)圖3 Cyclin B1蛋白在Ⅳ級膠質瘤細胞核中的陽性表達（SP×400）

Figure 4 The positive expression of protein PHH3 in gradeⅣ glioma(SP×400)圖4 PHH3蛋白在Ⅳ級膠質瘤細胞核中的陽性表達（SP×400）

Table 1 Comparison of Cyclin D1，Cyclin A，Cyclin B1 and PHH3 expressions between different grades of gliomas表1 各級膠質瘤中Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3的LI比較 （±s）

Table 1 Comparison of Cyclin D1，Cyclin A，Cyclin B1 and PHH3 expressions between different grades of gliomas表1 各級膠質瘤中Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3的LI比較 （±s）

**P<0.01

分級Ⅰ級（1）Ⅱ級（2）Ⅲ級（3）Ⅳ級（4）F n 10 15 15 19 Cyclin D1 0.68±0.92 5.00±4.93 11.50±7.66 17.24±10.41 13.356**Cyclin A 0.50±0.67 3.51±3.29 6.90±5.59 11.31±7.98 9.849**Cyclin B1 0.46±0.60 2.86±3.89 6.61±4.97 13.19±9.17 12.479**PHH3 0.30±0.33 0.69±0.79 5.63±3.34 16.54±8.36 36.121**

3 討論

腫瘤的發生及發展是復雜而漫長的過程，有多種可能的機制，如癌基因的過度擴增，抑癌基因的缺失，生長因子信號傳導通路的持續激活等。目前認為，這些機制可直接或間接影響細胞周期調控因子的功能，促進細胞周期持續演進，細胞進入自主無限制的增殖和分裂，表現出旺盛的增殖活性而發生惡性轉化。從一定程度上講，細胞周期是所有這些機制的“最后公路”。

Cyclin D1是G1期細胞周期素，與細胞同期依賴激酶（CDK4）或CDK6在G1期結合形成復合物，通過激活CDK4或CDK6，使后者催化一系列關鍵底物（如Rb蛋白）磷酸化導致轉錄因子釋放，促進DNA合成而發揮加速細胞增殖的正性調節作用。正常情況下，Cyclin D1蛋白只是在G1期呈一過性表達，任何原因引起Cyclin D1持續高表達都將使細胞增殖失控，最終形成腫瘤。許多人類腫瘤組織中均發現染色體11q13區域的Cyclin D1基因擴增和Cyclin D1蛋白的過度表達，在腫瘤的進展和轉移中起重要作用[5]。本研究結果顯示Cyclin D1在正常腦組織中不表達，在各病理等級的腦膠質瘤組織中均存在Cyclin D1的表達，且其表達水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢，說明膠質瘤組織中Cyclin D1的表達是存在的，并且在膠質瘤的發生發展過程中起重要作用，與腫瘤的惡性程度密切相關。

Cyclin A基因定位在染色體4q27上，它必須與CDK結合才能顯示酶的活性。Cyclin A是細胞周期進入S期所必須的調節蛋白[6]，它的過表達將導致處于S期的細胞明顯增多，促進細胞增殖。Cyclin A不僅在S期與DNA復制有關，而且在有絲分裂的起始階段也起著重要作用[7]。本研究結果顯示Cyclin A在正常腦組織中不表達，在各病理等級的腦膠質瘤組織中均存在Cyclin A的表達，并且其表達水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢，提示隨著腫瘤級別的增加，有越來越多的細胞增殖活躍。

在G2期主要是Cyclin B1的表達增加，有絲分裂結束時降低[8]。Cyclin B1蛋白的濃度變化控制著細胞由G2期向M期的過渡,Cyclin B1在G2/M檢測點的異常增高，是細胞惡性增殖的主要表現。Cy?clin B1在癌細胞中過表達，可能與激酶CDK1形成復合物，啟動有絲分裂，越過細胞周期檢查點，導致失控性的細胞增殖有關。本研究結果顯示Cyclin B1在正常腦組織中不表達，在各病理等級的腦膠質瘤組織中均存在Cyclin B1的表達，并且其表達水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢，提示Cyclin B1的過表達可增加進入G2/M期的細胞百分比，從而影響細胞周期的進程，促進細胞增殖。

真核細胞染色質的基本結構單位為核小體，組蛋白H3是核小體的組成成分之一。在分裂間期，組蛋白H3的絲氨酸殘基的磷酸化是微不足道的，而在分裂期，磷酸化則達到了最高峰。PHH3是一種抗磷酸化的組蛋白H3的抗體，組蛋白H3的磷酸化與有絲分裂染色體的濃縮相關，并且在細胞的凋亡過程中沒有組蛋白H3的磷酸化。本研究結果顯示PHH3在正常腦組織中不表達，在各病理等級的腦膠質瘤組織中均存在PHH3的表達，并且其表達水平隨著腫瘤惡性程度增高而呈升高趨勢。因此，PHH3可以作為核分裂的特殊標記以快速、有效、客觀地進行細胞增殖的定量分析[9]。

綜上，Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3在細胞周期調控過程中起關鍵作用，檢測腦膠質瘤組織中的Cyclin D1、Cyclin A、Cyclin B1和PHH3蛋白的表達水平，可輔助常規病理診斷并為判斷預后提供信息。

[1]Sherr CJ.Cancer cell cycles[J].Science,1996,274(5293):1672-1677.

[2]張雷.Cyclin B1與腫瘤發生發展[J].第三軍醫大學學報，2003，25（18）：1676-1678．

[3]孫永剛,彭貴勇,肖天利,等.食管癌組織中S期激酶相關蛋白2 mRNA的表達意義[J].第四軍醫大學學報，2006，27（6）：565-567.

[4]黃曼玲，楊玉珍.細胞周期蛋白與消化道腫瘤[J].胃腸病學和肝病學雜志，2004，15（5）：558-560．

[5]Nadal A,Cardesa A.Molecular biology of laryngeal squamous cell carcinoma[J].Virchows Arch,2003,442(1):1-7.

[6]葉菲，金銀姬，金曉明，等.周期蛋白A,E在胃低分化腺癌中表達的研究[J].哈爾濱醫科大學學報，2006，40（1）：1-3．

[7]Pagano M,Pepperkok R,Verde F,et al.Cyclin a is required at two points in the human cell cycle[J].EMBO J,1992,11(3):961-971.

[8]Dynlacht BD.Regulation of transcription by proteins that control the cell cycle[J].Nature,1997,389:149-152.

[9]Orchel J,Slowinski J,Mazurek U,et al.H3 mRNA level as a new pro?liferative marker in astrocytomas[J].Biochim Biophys Acta,2004,1689(1):42-46.