天津地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌16SrRNA甲基化酶基因的檢測與耐藥性分析

張利娟 郝邯生 畢 玲

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii，Ab）是醫(yī)院內(nèi)感染最常見的病原菌之一，其對(duì)β內(nèi)酰胺類、喹諾酮類以及氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性不斷增加，出現(xiàn)了多重耐藥以及泛耐藥菌株，甚至是“超級(jí)細(xì)菌”。氨基糖苷類抗生素廣泛用于革蘭陰性桿菌感染，其耐藥機(jī)制以往多集中在氨基糖苷類修飾酶的研究。近年來國內(nèi)外先后發(fā)現(xiàn)了氨基糖苷類耐藥的新機(jī)制16SrRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA）[1]。本研究旨在了解天津地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌16SrRNA甲基化酶基因攜帶情況，以及相關(guān)菌株的耐藥情況，為臨床抗菌藥物治療的合理選擇和合理應(yīng)用提供依據(jù)。

Table 1 Primers for PCR表1PCR引物序列

1 材料與方法

1.1 菌株來源及臨床資料 收集天津地區(qū)2所三級(jí)甲等醫(yī)院2010年8月—12月患者臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌152株。包括來源于呼吸道（痰、肺泡灌洗液等）129例、傷口分泌物7例、血液4例、腦脊液3例、尿液1例、其他8例。男106例，女46例，患者年齡1 d~96歲，其中1 d~4歲的新生兒及嬰幼兒分離的菌株（19株）多為敏感株。科室來源：重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）49例、神經(jīng)科31例、新生兒科17例、其他內(nèi)科33例、其他外科22例。

1.2 抗菌藥物藥敏紙片 所用紙片均購自天津市金章玉立科技發(fā)展有限公司。引物由北京六合華大基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 培養(yǎng)基 水解酪蛋白瓊脂（MH）購自上海伊華生物科技有限公司。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25022、銅綠假單胞菌ATCC27853為天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院天津市感染性疾病研究所保存。鮑曼不動(dòng)桿菌W61為經(jīng)過測序證實(shí)攜帶armA基因，肺炎克雷伯菌390為經(jīng)過測序證實(shí)攜帶rmtB基因，分別作為相應(yīng)基因的陽性對(duì)照。

1.5 試劑 Premix Taq DNA聚合酶、DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.6 方法

1.6.1 細(xì)菌鑒定及抗菌藥物敏感試驗(yàn) 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)采用全自動(dòng)分析儀檢測，部分頭孢哌酮/舒巴坦和多黏菌素B的藥敏檢測采用紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer），耐藥、中介、敏感的判讀依據(jù)美國CLSI中非發(fā)酵菌的判定標(biāo)準(zhǔn)，頭孢哌酮/舒巴坦參考頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn)。多重耐藥是指對(duì)5類（包括抗假單胞菌的頭孢菌素類、抗假單胞菌的碳青霉烯類、β內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、抗假單胞菌的喹諾酮類、氨基糖苷類）中的3類或者3類以上的抗菌藥物耐藥［2］。泛耐藥是指對(duì)上述5類均耐藥，但對(duì)多黏菌素和替卡西林敏感［3］。

1.6.2 細(xì)菌模板制備及基因檢測 采用煮沸法[4]制備DNA模板，-20℃保存。設(shè)計(jì)引物見表1。分別擴(kuò)增armA、rmtA、rm?tB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA基因。反應(yīng)體系為25 μL，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，0.5 mg/L EB染色，凝膠系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.6.4 PCR產(chǎn)物測序 由北京六合華大基因技術(shù)有限公司完成，結(jié)果經(jīng)BLAST程序和Genebank數(shù)據(jù)庫公布的標(biāo)準(zhǔn)菌序列進(jìn)行比對(duì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株對(duì)14種抗菌藥物的藥敏結(jié)果 152株鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)多黏菌素B（0）的耐藥率最低，其次為頭孢哌酮/舒巴坦（15.79%）和左氧氟沙星（36.84%），對(duì)其他11種抗菌藥物耐藥率均在45%以上。90株為多重耐藥菌株（59.21%），60株為泛耐藥菌株（39.47%），見表2。

Table 2 Antimicrobial susceptibility results of 152 strains Acinetobacter baumannii to 14 antimicrobial agents表2 152株鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)14種抗菌藥物的藥敏結(jié)果株（%）

2.2 16SrRNA甲基化酶基因的檢測 實(shí)驗(yàn)菌株中共有83株同時(shí)對(duì)慶大霉素和阿米卡星耐藥，armA基因陽性株73株，見圖1，占耐氨基糖苷類菌株的87.95%（73/83），占實(shí)驗(yàn)菌株的48.03%（73/152），未檢測出其他6種16SrRNA甲基化酶基因（rmtA、rm?tB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA）。基因測序結(jié)果與Gen?Bank armA序列比對(duì)，同源性符合率為98%~99%。

Figure 1 Amplification of armA gene by PCR圖1 PCR擴(kuò)增armA基因結(jié)果

2.3 armA陽性菌株與陰性菌株的耐藥率比較 73株armA基因陽性菌株耐藥嚴(yán)重，對(duì)慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星和哌拉西林的耐藥率均為100%，對(duì)除多黏菌素B外的其余13種抗菌藥物的耐藥率明顯高于armA陰性的菌株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），見表3。73株armA陽性菌株多重耐藥率為100%（73/73），泛耐藥率為69.86%（51/73），79株armA陰性菌株中多重耐藥率21.52%（17/79），泛耐藥率11.39%（9/79）。

Table 3 Comparison of drug resistance rate between armA gene positive strains and armA gene negative strains表3 armA基因陽性菌株和armA陰性菌株耐藥率比較株（%）

3 討論

氨基糖苷類抗菌藥物是臨床上治療革蘭陰性菌感染的重要藥物。該類藥物通過與原核生物30S核糖體亞基16SrRNA上A位點(diǎn)的一個(gè)高度保守基元結(jié)合，從而引起核糖體功能改變，使細(xì)菌蛋白在合成時(shí)錯(cuò)誤轉(zhuǎn)錄并抑制移位，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。以往認(rèn)為氨基糖苷類耐藥的主要機(jī)制為產(chǎn)生了氨基糖苷類修飾酶。2003年Galimand等［6］首次從泌尿系統(tǒng)分離的耐多藥肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了16SrRNA甲基化酶基因armA，研究表明該基因介導(dǎo)氨基糖苷類高水平耐藥。迄今為止發(fā)現(xiàn)的16SrRNA甲基化酶基因有 7種（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA），在鮑曼不動(dòng)桿菌中僅檢測到armA。16SrRNA甲基化酶使細(xì)菌30S核糖體亞單位中16SrRNA的A位點(diǎn)某個(gè)或某幾個(gè)堿基甲基化，使氨基糖苷類抗菌藥物不能與其作用靶點(diǎn)結(jié)合，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。其中armA使A位點(diǎn)G1405上的N-7甲基化，破壞了G1405上N7與4，6二取代脫氧鏈霉胺的3′氨基形成氫鍵，在空間上阻礙G1405和慶大霉素的結(jié)合。同時(shí)，甲基化給G1405引入正電荷，不利于該類藥物結(jié)合到解碼位點(diǎn)，從而介導(dǎo)對(duì)氨基糖苷類耐藥。

本研究首次對(duì)天津地區(qū)2所醫(yī)院鮑曼不動(dòng)桿菌臨床株中16SrRNA甲基化酶基因的攜帶情況進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，天津地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥嚴(yán)重，對(duì)多黏菌素B（0）的耐藥率最低，其次為頭孢哌酮/舒巴坦（15.79%）和左氧氟沙星（36.84%），對(duì)其他常用抗菌藥物的耐藥率在45%以上。本研究中對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦的敏感率為50%，對(duì)亞胺培南或美洛培南的敏感率為40.13%，這與中國CHINET鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)報(bào)道對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦敏感率為72.1%，對(duì)亞胺培南和美洛培南的敏感率為60.6%和55.5%相比[7]，敏感率低。

ArmA基因在韓國、北美、中國等多個(gè)國家和地區(qū)的鮑曼不動(dòng)桿菌中均有檢出[8]。近年來國內(nèi)湖南[9]、上海[10]等多個(gè)地區(qū)也有報(bào)道，國內(nèi)鮑曼不動(dòng)桿菌中armA的檢出率約為27%~60%，耐氨基糖苷類鮑曼不動(dòng)桿菌中armA的檢出率為37%~100%。本研究顯示天津地區(qū)armA甲基化酶基因在鮑曼不動(dòng)桿菌中的檢出率為48.03%，在氨基糖苷類耐藥菌株中的檢出率為87.95%，未檢測到rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、npmA。

對(duì)armA基因陽性和陰性菌株進(jìn)行耐藥率比較時(shí)發(fā)現(xiàn)，armA陽性菌株除多黏菌素B外，對(duì)其余13種抗菌藥物的耐藥率均明顯高于armA陰性菌株，并且armA陽性菌株多重耐藥率和泛耐藥率遠(yuǎn)高于陰性菌株，這可能與armA基因通常由質(zhì)粒攜帶，而質(zhì)粒等移動(dòng)元件通常同時(shí)攜帶更多的耐藥基因有關(guān)，相應(yīng)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究中armA基因陽性菌株均為多重耐藥菌株，但其在臨床治療上是否應(yīng)按照多重耐藥菌株選擇抗菌藥物仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

近年來鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離率和多重耐藥率逐年增高，16SrRNA甲基化酶基因armA在鮑曼不動(dòng)桿菌中廣泛存在，引起臨床醫(yī)師的高度關(guān)注；探討其耐藥特點(diǎn)對(duì)臨床治療中合理選擇抗菌藥物有指導(dǎo)意義；進(jìn)一步研究16SrRNA甲基化酶基因armA陽性菌株的多重耐藥對(duì)探討不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制有深層意義。

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