防御素5和LL37真核重組質粒構建及轉染人陰道上皮細胞的研究

王 芳 尹利榮 孫 蓓

人類的機體時刻被來自外在和內在的多種微生物圍攻，先天免疫系統可以抵抗一些潛在的病原體，這類具有抗菌活性的肽和微量蛋白的產物統稱為抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），AMPs是宿主先天免疫的一部分[1]。女性下生殖道為開放性腔道，當受到內源或外源性因素影響時，以乳桿菌等優勢菌為主要組成的微生態系統很容易發生改變，導致疾病的發生[2]。本研究通過構建AMPs中防御素5（HD5）和LL37的真核重組質粒，并瞬時轉染人陰道上皮細胞，以期探討陰道上皮細胞抵抗微生物感染的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 pcDNA3.1（+）表達質粒購自Invitrogen公司；pcDNA3.1（+）-EGFP表達質粒由天津醫科大學內分泌研究所構建；T4連接酶、限制性內切酶EcoRⅠ、KpnⅠ、NotⅠ購自TaKaRa公司；KOD dash酶購自TOYOBA公司；pGEM-T Easy載體、質粒抽提試劑盒、M-MLV逆轉錄酶及RNA酶抑制劑為Promega公司產品；Oligo（dT）18購自上海生工生物工程有限公司；Trizol和細胞轉染用Lipofectamine 2000試劑盒購自Invitrogen公司；氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自華美生物工程公司；β-巰基乙醇、瓊脂糖、甘氨酸、溴化乙錠（EB）為美國Sigma公司產品；酵母提取物（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone）、瓊脂（Agar）、角質形成細胞無血清培養基（K-SFM）、胎牛血清、DMEM/F12培養基均為GIBCO公司產品。DNA快速純化回收試劑盒，高純質粒提取試劑盒均購自Biomega生物技術公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自PIERCE公司。大腸桿菌E.coli JM109菌株為天津醫科大學內分泌研究所保存。人HD5定量酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒最小可測濃度為0.1 μg/L，人LL37定量ELISA試劑盒最小可測濃度為0.14 μg/L，以上2種試劑盒均購自瑞科生物技術有限公司。GeneAmp PCR System 9600擴增儀為美國Perkin Elmer Cetus公司產品。

1.2 重組pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP真核表達載體的構建

1.2.1 提取陰道總RNA并逆轉錄為cDNA 本研究獲得我院倫理委員會批準，組織提供者均鑒署知情同意書。采用Trizol試劑一步法提取健康育齡女性陰道黏膜上皮細胞（細胞取自我院婦科門診體檢女性）的總RNA，經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。在不同波長下檢測電泳條帶的光密度（OD）值，若OD260/OD280介于1.8~2.0，OD260/OD230介于1.5~1.9，說明RNA純度較高。然后逆轉錄成cDNA。

1.2.2 擴增獲編碼HD5和LL37成熟肽的DNA序列 PCR引物根據Gene Bank核酸數據庫應用Primer 5.0設計，委托北京奧科生物公司合成。并在引物的兩端加入限制性內切酶的酶切序列。引物序列為：HD5-正義5′-CGGGGTACC ATGAGGACCATCGCC-3′；HD5-反義5′-ATAAGAATGCGG CCGCGCGACAGCAGAGTCTG-3′。LL37-正義5′-CGGGGT ACCATGAAGACCCAAAG-3′；LL37-反義 5′-ATAAGAATGC?GGCCGCGGACTCTGTCCTGG-3′。GGTACC為KpnⅠ的酶切位點，GCGGCCGC為NotⅠ的酶切位點。PCR條件：以cDNA為模板，預變性95℃5 min，隨后按94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s。35次循環后，72℃繼續延伸5 min，最后加入1U普通Taq DNA聚合酶72℃反應1 h。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.2.3 目的基因轉入pGEM-T Easy載體 用DNA快速純化回收試劑盒按使用說明進行操作，將上述PCR產物進行回收。將目的基因與pGEM-T載體連接，反應體系為：pGEM-T載體1 μL；T4 DNA連接酶1 μL；2×Ligase Buffer 5 μL；PCR回收產物3 μL，共計10 μL。加入離心管，4℃連接過夜。將連接產物轉化感受態E.coliJM109，經藍白斑篩選，挑取陽性菌落，培養后進行PCR檢測。檢測為陽性者，將菌液擴大培養，提取質粒。

1.2.4 構建 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP和 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP真核重組質粒 含有目的基因的克隆載體和pcDNA3.1（+）質粒分別用內切酶KpnⅠ、NotⅠ雙酶切過夜（37℃）。將酶切后分別回收的基因片段和pcDNA3.1(+)質粒混合，加入T4 DNA連接酶，置于16℃水浴中連接過夜。10 μL連接產物轉化大腸桿菌E.coli JM109 100 μL（方法同前），涂布于LB平板培養基上，37℃過夜培養，挑選單個菌落，經LB液體培養基培養后進行PCR檢測。檢測為陽性者，將菌液擴大培養，提取重組質粒。

1.2.5 重組質粒的酶切鑒定和序列分析 將重組質粒用限制性內切酶KpnⅠ和NotⅠ酶切鑒定，反應體系為：重組質粒DNA 3 μL，10×Buffer 2 μL，內切酶KpnⅠ和NotⅠ各0.5 μL，加去離子水4 μL，37℃酶切過夜。陽性重組質粒由北京奧科生物技術有限責任公司測序。

1.3 人陰道上皮細胞的培養和傳代 人陰道上皮細胞取材于因子宮肌瘤或子宮腺肌病行全子宮切除的育齡期患者陰道壁組織。術前宮頸細胞學檢查無異常，抗感染篩查為陰性，術后病理檢查為良性疾病。參考吳文湘等[3]的方法采用K-SFM和組織塊法進行陰道上皮細胞體外培養，將新鮮陰道組織放入加有抗生素（慶大霉素50 μg/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL）的4℃D.Hank’s液無菌小瓶內。經消毒、分離后將組織碎塊接種于一次性培養瓶中，加入含抗生素的K-SFM培養基（兩性霉素B 0.25 mg/L，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL），在37℃，6%CO2孵育箱中培養。當上皮細胞接近90%以上融合時，用質量分數0.1%的胰蛋白酶/質量分數0.01%的乙二胺四乙酸消化液按體積比1∶2或1∶3進行傳代，傳至第4代準備試驗。苔盼藍染色檢測細胞活力。

1.4 AMPs真核重組質粒轉染陰道上皮細胞 以0.5×105的密度將細胞接種于24孔細胞培養板，加入500 μL無抗生素K-SFM培養基至細胞融合率達80%~90%時，分別將質粒pcDNA3.1（+）-EGFP、pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP與Lipofectamine2000混合后按轉染試劑盒的操作說明轉染細胞。轉染pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP為HD5組、轉染 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP為LL37組、轉染pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP和pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP為聯合轉染組、未轉染質粒細胞為未轉染組，同時設置一空載質粒為空白對照組。每孔設2個復孔。

1.5 抗菌肽LL37及HD5表達情況檢測 分別于轉染后6、12、24及48 h用熒光顯微鏡觀察真核重組質粒瞬時轉染陰道上皮細胞情況，收集各組細胞培養上清液凍存于-80℃，收齊標本后用ELISA方法檢測LL37及HD5含量，實驗步驟按試劑盒說明進行。

1.6 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，計量資料結果以±s表示。多組各時點HD5、LL37值的比較采用重復測量資料的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP 和 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP真核表達載體的構建

2.1.1 人陰道上皮細胞總RNA的提取 經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，28 s與18 s的密度比值約為2，總RNA的完整性較好，基本無降解，見圖1。

Figure 1 Electrophoresis of RNA in denaturing formaldehyde agarose gels圖1 RNA甲醛變性電泳圖

2.1.2 人HD5和LL37基因的獲取 以cDNA為模板，分別擴增出產物長度約為307 bp的HD5和538 bp的LL37成熟肽編碼序列，見圖2。

Figure 2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products圖2 PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.1.3 真核重組質粒pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP的酶切鑒定 經限制性內切酶KpnⅠ和NotⅠ對重組質粒酶切可見約307 bp、538 bp左右2條片段，經測序證實其結果與GenBank上報道的HD5cDNA和LL37cDNA序列完全一致，目的基因全已連入pcDNA3.1（+）-EGFP載體，序列完全正確，讀碼框架正確，質粒構建成功，見圖3。

Figure 3 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP and pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP圖 3 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP和pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP重組質粒酶切鑒定

2.2 人陰道上皮原代培養的細胞特點、活性及純度鑒定 陰道上皮組織接種后4~6 d，從小組織塊周邊可見生長出來的陰道上皮原代細胞呈多角形，如鋪路石狀，細胞體積較小，大小均一，胞質均勻明亮，輪廓清晰光滑，折光性強，倒置相差顯微鏡下有立體感。上皮細胞逐漸生長融合成片，原代培養10 d左右細胞融合。每代細胞生長至85%~90%融合時傳代。第3~6代細胞形態良好，與原代無明顯區別，是細胞生長的黃金時期，細胞傳代的貼壁率明顯提高，在增殖期間細胞核分裂象多見，見圖4。傳代至第3代即可進行轉染。苔盼藍排斥試驗檢測細胞活力可達90%~95%，顯微鏡下計數上皮細胞純度達99%以上。

Figure 4 The growth status of cultured primary human vaginal epithelial cells(×10)圖4 原代培養的陰道上皮細胞生長情況（×10）

2.3 重組質粒pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP及pcDNA 3.1（+）/LL37-EGFP的瞬時轉染效率及目的基因的表達

2.3.1 陰道上皮細胞的轉染情況 在轉染細胞的胞膜和胞內有較強的綠色熒光，且轉染細胞陽性率近100%，24 h時轉染率最高，見圖5。

Figure 5 The LL37 and HD5 gene expression of human vaginal epithelial cells after transfection of recombinant plasmid pcDNA3.1(+)/LL37-EGFP(A)and pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP(B)for 24 hours（×20）圖5 轉染質粒pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP（A）和pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP（B）時陰道上皮細胞LL37和HD5的基因表達（×20）

2.3.2 各組細胞不同時段LL37及HD5的表達水平 同一時段各組組間LL37水平差異有統計學意義（F組間=849.138，P<0.001）。聯合轉染組高于LL37組，LL37組高于未轉染組，差異均有統計學意義（均P<0.001）。組內不同時間LL37水平差異均有統計學意義（F時間=3 410.030，P<0.001），除未轉染組外，其他2組均是6 h時分泌最低，24 h達高峰，然后呈下降趨勢。組間和處理時間之間存在交互效應（F交互=13 211.408，P<0.001），見表1。同一時段各組組間HD5水平差異有統計學意義（F組間=609.262，P<0.001）。聯合轉染組高于HD5組，HD5組高于未轉染組，差異均有統計學意義（均P<0.001）。組內不同時間HD5水平差異均有統計學意義（F時間=1 086.068，P<0.001），HD5組隨時間增加，HD5水平呈增加趨勢；聯合轉染組6 h時分泌最低，24 h達高峰，然后呈下降趨勢。組間和處理時間之間存在交互效應（F交互=6 130.852，P<0.001），見表2。

Table 1 Comparison of LL37 levels in different time points between three groups表1 不同時段各組LL37水平比較 （μg/L ±s）

Table 1 Comparison of LL37 levels in different time points between three groups表1 不同時段各組LL37水平比較 （μg/L ±s）

F組間=849.138**，F時間=3 410.030**，F交互=13 211.408**；**P<0.001

組別未轉染組LL37組聯合轉染組F 6 h 0.69±0.06 17.34±0.26 19.34±0.58 2 293.884**12 h 0.69±0.03 36.62±1.02 37.82±0.67 2 711.096**24 h 0.81±0.04 63.34±1.05 64.49±0.68 7 625.269**48 h 0.70±0.02 23.51±0.97 25.20±1.03 839.727**F 9.730 1 492.582**1 998.456**

Table 2 Comparison of HD5 levels in different time points between three groups表2 不同時段各組HD5水平比較 （mg/L， ±s）

Table 2 Comparison of HD5 levels in different time points between three groups表2 不同時段各組HD5水平比較 （mg/L， ±s）

F組間 =609.262**，F時間 =1 086.068**，F交互 =6 130.852**；**P<0.001

組別未轉染組HD5組聯合轉染組F 6 h 1.17±0.04 8.22±0.30 17.10±0.14 5 031.095**12 h 1.12±0.08 12.02±0.61 28.01±1.26 835.694**24 h 1.10±0.03 14.94±0.42 50.07±1.19 3 592.806**48 h 1.11±0.04 16.94±0.42 37.76±0.41 8 784.427**F 2.145 238.871**917.759**

3 討論

人體上皮細胞可產生3大類AMPs，包括防御素、Cathelicidins和富組蛋白。防御素是一種兼兩性的陽離子多肽，HD5屬于防御素α亞家族，除了由人腸道潘氏細胞分泌，HD5也可在雌性生殖道復層上皮細胞表達，包括陰道、子宮頸、子宮內膜和輸卵管，在胎盤和胎膜中也有HD5存在[4]。Dürr等[5]觀察到女性生殖道不同位置都有HD5的表達，并且在陰道沖洗液中檢測到高濃度的HD5。人源性陽離子抗菌肽-18（hCAP-18）是Cathelicidins家族中唯一存在于人體的AMPs，hCAP-18經絲氨酸蛋白酶3裂解產生LL37。LL-37由中性粒細胞、巨噬細胞及各種不同的上皮細胞產生。

AMPs抗致病原微生物種類廣泛，包括革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、寄生蟲、包膜病毒，甚至非微生物類的腫瘤細胞[6]。這些天然分子殺滅多重耐藥微生物的能力已得到相當重視和臨床關注[1]。AMPs的作用機制是通過肽-膜質作用攻擊靶細胞膜形成離子通道，使細胞內容物外滲而殺菌，可有效殺滅病原體[7]。作為一種陽離子小肽，AMPs以其高效、廣譜、抗菌機制獨特等優點，日益成為最具開發前景的新型抗菌藥物。但從天然資源中提取AMPs成本高、獲得率低、工序繁瑣；化學合成則價格昂貴，也難以應用于臨床，這成為AMPs開發的瓶頸，因此利用基因工程技術生產AMPs具有重要意義和廣闊前景。

AMPs出現在人體所有接觸微生物的部位如皮膚和黏膜，多由感染或損傷導致[8]。女性陰道是一個復雜的微生態系統，是由多種微生物構成的動態平衡體系[2]。陰道微生態平衡一旦被破壞,如菌群失調、免疫功能低下、大量使用抗生素等，陰道上皮細胞可以合成AMPs抵御病原體。研究發現陰道內HD5水平在不同的感染狀態下均有明顯升高[9]，提示了先天性免疫因子HD5參與了下生殖道感染的發病過程。Valore等[10]研究顯示正常對照組陰道灌洗液中HD5的水平范圍為10~40 μg/L。這些宮頸陰道分泌物的成分隨著月經周期、雌激素治療及感染情況而改變[11]。然而天然合成的量有限，往往不足以抵御病原體感染而導致疾病的發生。通過人工方法增加AMPs的分泌，為增強陰道上皮細胞抗菌性進行基因干預是本實驗的目的。

本研究24 h轉染細胞陽性率近100%，熒光顯微鏡下可見大量綠色熒光，證明成功構建了重組質粒 pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP 及 pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP轉染陰道上皮細胞。細胞上清液結果證明，抗菌肽LL-37及HD5能夠在陰道上皮細胞中表達，陰道上皮細胞轉染pcDNA3.1（+）/LL37-EGFP或（和）pcDNA3.1（+）/HD5-EGFP質粒后，LL37及HD5分泌水平均顯著高于未轉染組，且聯合轉染高于單獨轉染組，說明LL37及HD5的分泌具有協同促進作用。未轉染組不同時段的LL3及HD5均保持在低水平穩定狀態，證實陰道上皮細胞在自然狀態下有一定量AMPs分泌，但這種分泌是一種持續的低水平狀態。人工轉染質粒后陰道上皮細胞分泌AMPs的量明顯增加，分泌量在24 h達峰值。瞬時轉染48 h后，基因轉染效率開始降低，推測可能與瞬時轉染本身的特點有關，也可能是重組基因引起了陰道上皮細胞凋亡。

有研究發現HD5及LL37不僅對病原體有直接的抵抗作用，而且具有調節宿主免疫功能的作用，HD5可以誘導結腸細胞系分泌IL-8[12]。LL37也可刺激髓細胞及上皮細胞的細胞因子尤其是IL-8的產生，調節細胞免疫反應，增強炎癥感染部位中性粒細胞的宿主防御功能[13]。HD5及LL37的表達增加能否同時刺激陰道上皮細胞炎性趨化因子的表達有待進一步研究。

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