依達拉奉對腦出血大鼠血腫周圍組織Caspase-3和Pdcd-5蛋白表達的影響*

趙 彬 劉 斌 張玉芹

腦出血后通常存在細胞凋亡[1]。依達拉奉（Eda?ravone）是一種新型自由基清除劑，具有抗細胞凋亡和神經保護的作用[2]。臨床研究表明，依達拉奉對治療腦出血有確切療效[3]。本研究旨在觀察依達拉奉對大鼠腦出血血腫周圍組織胱冬酶-3（Caspase-3）和程序性細胞死亡分子-5（programmed cell death-5，Pdcd-5）蛋白表達的影響及其作用機制，為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：普通級雄性Wistar大鼠102只，體質量250~300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：Scxk（京）-2010-0001。隨機分為假手術組6只、腦出血組48只和依達拉奉治療組48只。后2組根據動物術后處死時間的不同又分為3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d及7 d共8個亞組，每組6只。（2）主要試劑：Caspase-3和Pdcd-5多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。依達拉奉注射液購自南京先聲藥業公司，批號040181。

1.2 模型制作 參照李慧等[4]報道的方法，所有大鼠術前禁食、水，以100 g/L水合氯醛（購于天津市大茂化學試劑廠，300 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，正中切開頭皮，以前囟中央為原點，于前囟后1.4 mm，中線向右旁開3.2 mm處用牙科鉆鉆一直徑為1 mm的小孔至顱骨下硬膜，用40℃溫水浸泡鼠尾數分鐘，消毒后斷尾取自體血50 μL。腦出血組和依達拉奉治療組用微量注射器沿鉆孔方向垂直進針，深約5.6 mm，接著緩慢均速推注50 μL血入腦，注血后留針10 min后緩慢退出，拔除后用醫用骨蠟封閉骨孔，觀察無出血后，縫合頭皮，加壓包扎尾部。假手術組除不注射自體血外，余操作同出血組。依達拉奉治療組于腦出血模型制備成功后2 h腹腔內注射依達拉奉3 mg/kg，每日1次，用藥到實驗結束。假手術組和腦出血組給與等量生理鹽水。模型成功的標準：（1）提尾時大鼠血腫對側前肢內收屈曲。（2）爬行時向血腫對側傾倒或按逆時針方向轉圈。所有大鼠均造模成功。

1.3 腦組織標本制備 術后在各相應時點適量水合氯醛麻醉動物，迅速開胸暴露心臟，從左心室插管至主動脈根部，在右心耳剪開一小口做出口。快速滴入37℃生理鹽水300 mL，無血污后改為滴入固定液4℃多聚甲醛甲醛磷酸鹽緩沖液400 mL。于術后各時點處死取腦，以血腫為中心按冠狀位切取血腫周圍2 mm的腦組織，固定于4%多聚甲醛溶液中12~24 h，進行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續切片，厚度約5 μm，用經多聚賴氨酸處理過的載玻片撈片，晾干后于60℃的烤箱中烘烤備用。

1.4 Caspase-3和Pdcd-5蛋白免疫組化檢測 采用免疫組化SP法嚴格按試劑盒的步驟和要求完成。陽性細胞判定標準：光鏡下Caspase-3和Pdcd-5蛋白以細胞胞質呈棕黃色著色為陽性細胞。

1.5 圖像分析 隨機觀察腦出血血腫周圍腦組織不重疊的6個高倍視野（×200），采用高清晰度彩色病理圖像分析系統IPP（Image pro plus）計數Caspase-3、Pdcd-5免疫反應陽性細胞數，取其平均值為陽性細胞數。

1.6 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

假手術組可見少量散在的Caspase-3和Pdcd-5蛋白陽性細胞表達，由于陽性細胞數極少，故未進行統計學檢驗。腦出血組于出血后3 h即有Caspase-3和Pdcd-5陽性細胞表達，12 h明顯增多，1~2 d達高峰，3 d后陽性細胞表達逐漸減少。治療組3 h有陽性細胞表達，隨著出血時間的延長陽性細胞表達逐漸增多，1~2 d達高峰，3 d后開始下降。2組Caspase-3和Pdcd-5蛋白陽性細胞于出血后3 h差異無統計學意義（P>0.05），其余各時點差異有統計學意義（P<0.05或 P<0.01），見表1、2。

Table 1 Comparison of Caspase-3 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表1 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Caspase-3陽性細胞數的比較 （n=6，個±s）

Table 1 Comparison of Caspase-3 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表1 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Caspase-3陽性細胞數的比較 （n=6，個±s）

*P<0.05，**P<0.01

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Table 2 Comparison of Pdcd-5 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表2 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Pdcd-5陽性細胞數的比較 （n=6，個 ±s）

Table 2 Comparison of Pdcd-5 positive cells in the perihematoma region after intracerebral hemorrhage in different rat groups表2 各觀測點腦出血大鼠血腫周圍組織Pdcd-5陽性細胞數的比較 （n=6，個 ±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別腦出血組治療組t 3 h 4.84±0.44 4.16±0.80 1.82 6 h 9.82±0.87 7.15±1.34 4.09**12 h 15.26±1.27 13.46±1.17 2.55*1 d 24.82±1.08 21.52±0.95 5.61**2 d 34.74±2.79 29.84±2.04 3.47**3 d 29.91±1.56 25.80±1.79 4.24**5 d 21.14±1.93 17.77±1.22 3.62**7 d 12.30±0.96 10.45±1.72 2.30*組別腦出血組治療組t

3 討論

細胞凋亡在腦出血繼發性腦損傷中起重要作用[1]。細胞凋亡過程復雜，受多種基因及其產物調控。Caspase是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶，而Caspase-3是Caspase家族最主要的成員之一，是細胞凋亡發生的關鍵酶[5]。其可激活特定信號系統，產生核皺縮，造成DNA片段形成等凋亡現象，最終控制著凋亡的發生和發展[6]。Pdcd-5基因是由北京大學人類疾病基因中心從人白血病細胞株TF-1細胞中克隆到的凋亡相關新基因之一。有研究采用反義封閉和抗體封閉實驗表明，內源性的Pdcd-5在細胞凋亡過程中發揮重要的正調控效應，它可能作為Caspase-3的正調控因子參與細胞凋亡[7]。筆者先前研究表明，腦出血大鼠血腫周圍組織存在細胞凋亡，且伴隨Caspase-3和Pdcd-5蛋白表達的變化而改變，Caspase-3和Pdcd-5蛋白可促進腦出血后血腫周圍組織細胞凋亡的發生[8]。因此，臨床上針對細胞凋亡及凋亡相關基因的調控將可能成為治療腦出血的關鍵步驟。

依達拉奉的化學結構為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮,是相對分子質量為174.20的親脂性基團，在體內以陰離子形式存在，并可轉移一個電子給自由基而產生依達拉奉基團，打斷脂質過氧化反應鏈，進而保護神經細胞[9]。有研究表明，依達拉奉可抑制腦出血后血腫周圍組織的細胞凋亡，對出血后腦組織起到神經保護作用[10]。本研究結果顯示，與出血組相比，依達拉奉治療組的Caspase-3和Pdcd-5陽性細胞于出血6 h后各時點表達均有減弱，提示依達拉奉能抑制Caspase-3蛋白和Pdcd-5蛋白的表達，減輕腦損傷，對腦出血后腦組織損傷有保護作用。

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[10]劉斌,趙紫燁,李建民,等.依達拉奉對腦出血大鼠血腫周圍組織細胞凋亡及P38M-APK蛋白表達的影響[J].中國藥房,2010,21（13）：1173-1175.