葉黃素預處理對順鉑損傷大鼠肝超微結構的影響

張慧珠 劉淑梅 白 靜 張博男 勾向博

順鉑（cisplatin，CP）是一種廣譜抗腫瘤藥物，對多種實體瘤具有良好的治療作用。但其嚴重的不良反應，包括腎損害、胃腸道損害、骨髓抑制、耳毒性和肝毒性等，大大限制了其在臨床的應用。廣泛深入地研究CP的組織損傷機制，對于預防和減輕其不良反應具有重要意義。以往研究認為CP的毒性與氧化應激、炎癥、基因損傷及細胞周期抑制等有關[1-2]，故推論抗氧化劑對其毒性應具有一定抑制作用。本研究選取具有較強抗氧化作用的葉黃素（lu?tein，LU）作為干預藥物，觀察其對CP損傷大鼠肝組織及肝超微結構的影響，為臨床防治CP肝毒性提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 SPF級雌性SD大鼠24只，平均體質量（160.6±15.5）g，購于中國醫學科學院實驗動物研究所，許可證編號：SCXK（京）2009-0004，合格證號0168693。適應性喂養1周后隨機分為生理鹽水組（NS組）、CP組和葉黃素預防組（LU+CP組），每組8只。

1.1.2 儀器及試劑 注射用順鉑（批號09010201），山東羅欣藥業股份有限公司產品，臨用前用生理鹽水配制成1 g/L；葉黃素（批號20100325，葉黃素含量88.6%），北京禹光生物科技公司產品，臨用前用玉米油溶解，質量濃度為20 g/L。CHD型光學顯微鏡（日本，Olympus）；圖像采集及圖像分析系統（美國，Bio-Rad）。H7650型透射電鏡（日本，Hitachi）。

1.2 方法 動物喂養及處理 各組大鼠均采用基礎飼料，同條件喂養。NS組每天灌服玉米油2 mL/kg，7 d后腹腔注射生理鹽水5 mL/kg；CP組每天灌服與NS組等量的玉米油，7 d后一次性腹腔注射1 g/L的CP 5 mL/kg；LU+CP組每天灌胃20 g/L的LU油溶液2 mL/kg，7 d后一次性腹腔注射與CP組等量的CP。各組注射生理鹽水或CP后繼續灌服玉米油或葉黃素4 d，第5天各組大鼠斷頭處死并剖取肝臟。

1.3 觀察指標 肝臟病理結構觀察 取2 mm×2 mm×2 mm肝左葉尖部于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腎臟病理結構的改變。

1.4 肝臟超微結構觀察 取1 mm×1 mm×1 mm肝左葉尖部于2.5%戊二醛固定，經0.1%磷酸緩沖液漂洗3次，以1%鋨酸固定，經過50%、70%、90%、100%丙酮逐級脫水，環氧樹脂618與環氧丙烷（1∶1）浸透1 h，純包埋液浸透2 h，純包埋液固化（37℃24 h，60℃48 h），超薄切片。經過醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，用透射電鏡觀察大鼠肝臟超微結構變化并攝片。

2 結果

2.1 3組大鼠肝臟病理圖比較 NS組大鼠肝組織結構未見異常，正常肝細胞為較大的多邊形細胞，胞核為圓形。細胞質嗜酸性較強，肝血竇圍繞肝小葉中心與整齊排列的肝索間隔排列，見圖1a。CP組大鼠肝細胞排列紊亂，肝細胞壞死，細胞質多呈現空泡，細胞萎縮，肝門管區有較多淋巴細胞浸潤及少量纖維組織增生，見圖1b。LU+CP組大鼠肝損傷明顯減輕，細胞排列整齊，只有少數細胞有空泡，肝門管上皮細胞纖維化作用明顯減輕，見圖1c。

Figure 1 Light microscopic images of HE-stained rat liver tissues(×200)圖1 大鼠肝組織HE染色切片光鏡照片（×200）

2.2 3組大鼠肝臟超微結構圖比較 NS組大鼠肝細胞呈多邊形，膜相結構界限清楚，厚薄均勻。基質豐富，呈中等電子密度。細胞質中布滿細胞器，線粒體圓形或橢圓形，嵴正常而清晰，粗面內質網發達并呈層狀分布，可見糖原。細胞核圓形，常染色質多，核仁清楚。血竇面肝細胞微絨密集，貯脂細胞胞質內可見大小不等的脂滴，見圖2a、b。CP組肝細胞基質疏松，出現空泡，細胞器明顯減少，粗面內質網排列紊亂，呈現片層結構，線粒體萎縮或腫脹，嵴斷裂或消失。細胞核固縮，異染色質明顯增加、濃縮邊集，有些可見凋亡小體；膽小管擴張，見圖2c、d、e、f。LU+CP組肝損傷明顯輕于CP組，肝細胞胞漿內有少量空泡化改變，程度較輕。伴有輕度的線粒體腫脹，嵴結構模糊。粗面內質網擴張，肝細胞核內雖然也可見異染色體增加和邊集，但與CP組大鼠肝細胞比較，其超微結構的病理性改變明顯減輕，見圖2g、h。

Figure 2 The ultrastructure of rat liver tissues by electron microscopy圖2 大鼠肝組織超微電鏡圖

3 討論

CP在肝臟的蓄積量僅次于腎臟，故高劑量CP常會導致肝損害[3]。本研究采用一次性腹腔注射CP 5 mg/kg的方法，造成大鼠急性肝損傷的模型。肝組織切片檢查發現大鼠肝組織出現空泡、壞死、炎性浸潤、門靜脈周圍纖維化及肝索結構明顯被破壞等病理變化。透射電鏡顯示細胞核固縮，粗面內質網擴張，呈片層狀，線粒體出現腫脹或萎縮，嵴結構被破壞，甚至出現空泡改變，進一步證明了CP對肝組織的損傷。研究認為，CP對細胞的殺傷作用主要是通過形成DNA加成物，導致細胞停留于細胞周期的G2期而觸發細胞凋亡[4]。此外，在酒精性肝纖維化大鼠中，誘導細胞色素P450 2E1可通過氧化應激作用使纖維化作用加強[5]。這是因為細胞色素P450 2E1主要在肝臟表達，與其他類型的細胞色素P450不同，其與NADPH-細胞色素P450還原酶結合不緊密，CYP 2E1顯示出很強的NADPH氧化酶活性，可產生大量的超氧化物陰離子自由基（O2-）和過氧化物，在鐵催化劑存在的情況下可產生更強的氧化劑如羥自由基（OH-）。故誘導CYP 2E1，可增強鐵和多不飽和脂肪酸引起的肝臟毒性。CP肝毒性可因細胞色素P450 2E1的過度表達而增強[6]，故其誘導的氧自由基產生增加及氧化應激作用參與了肝損傷。因此，具有抗氧化作用的物質對CP導致的肝損傷均可表現一定的保護作用，如硒和高劑量維生素E口服可保護肝臟免受CP所導致的氧化損傷[7]；血紅素氧化酶及過氧化氫酶在CP對荷瘤小鼠的肝損傷過程中均起一定保護作用[8]；降低還原型谷胱甘肽（GSH）水平可使CP對原代培養的大鼠肝細胞毒性增加，而GSH的前體L-半胱氨酸則可起保護作用[9]。其他具有抗氧化作用的中藥單體如水飛薊素[10]、硒和?；撬岬萚11]對CP導致的肝損傷均具有保護作用。

葉黃素是廣泛存在于植物中的一種類胡蘿卜素，由2個六元碳環經1個含十八碳原子的共軛雙鍵長鏈聯接形成，屬于脂溶性植物色素。由于其結構中共軛雙鍵的存在，使其能夠淬滅單線態氧，從而抑制具有破壞性的自由基的形成。除了可用于預防老年性黃斑區病變，對多種氧化應激性疾病如衰老[12]、癌癥[13]及糖尿病性組織病變[14]等均可有防治作用。

本研究將大鼠用LU預處理后再給予大劑量CP，光鏡下可見大鼠肝細胞排列整齊，肝索結構正常，細胞空泡明顯減少，肝門管區纖維化作用減輕。電鏡下可見細胞核異染色質減少，線粒體損傷減輕。從形態結構顯示了葉黃素對CP所導致的肝損傷具有保護作用。證明了LU預處理可減輕CP導致的肝毒性作用。

[1]Cetin R,Devrim E,Kilicoglu B,et al.Cisplatin impairs antioxidant system and causes oxidation in rat kidney tissues:possible protec?tive roles of natural antioxidant foods[J].J Appl Toxicol,2006,26(1):42-46.

[2]Arany I,Saf i rstein RL.Cisplatin nephrotoxicity[J].Semin Nephrol,2003,23(5):460-464.

[3]Liao Y,Lu X,Lu C,et al.Selection of agents for prevention of cisplat?in-induced hepatotoxicity[J].Pharmacol Res,2008,57(2):125-131.

[4]Kishimoto S,Miyazawa K,Terakawa,et al.Cytotoxicity of cis-[((1R,2R)-1,2-cyclohexanediamine-N,N')bis(myristato)]-platinum(II)suspended in lipiodol in a newly established cisplatin-resistant rat hepatoma cell line[J].Jan J Cancer Res,2000,91(12):1326-1332.

[5]Tsukamoto H.Oxidative stress,antioxidants,and alcoholic liver fi?brogenesis[J].Alcohol,1993,10(6):465-467.

[6] Lu YK,Cederbaum AI.Cisplatin-induced hepatotoxicity is en?hanced by elevated expression of cytochrome P450 2E1[J].Toxicol sci,2006,89(2):515-523.

[7]Naziroglu M,Karaoglu A,Aksoy AO.Selenium and high dose vita?min E administration protects cisplatin-induced oxidative damage to renal,liver and lens tissues in rats[J].Toxicology,2004,195(2-3):221-230.

[8]Lu Y,Kawashima A,Horii I,et al.Effects of BSO and L-cysteine on drug-induced cytotoxicity in primary cell cultures:Drug-,cell type,and species-specific difference[J].Drug Chem Toxicol,2004,27(3):269-280.

[9]Heba HM,Hafez FH,Nadia MF.Silymarin modulates cisplatin-in?duced oxidative stress and hepatotoxicity in rats[J].J Biochem Mol Biol,2006,39(6):656-661.

[10]Liao Y,Lu X,Lu C,et al.Selection of agents for prevention of cispla?tin-induced hepatotoxicit[J].Pharmacol Res,2008,57(2):125-131.

[11]Santosa S,Jones PJ.Oxidative stress in ocular disease:Does lutein play a protective role[J]?CMAJ,2005,173(8):861-862.

[12]裴凌鵬,惠伯棣,董福慧.葉黃素改善老齡大鼠抗氧化功能的研究[J].中央民族大學學報:自然科學版,2007,16(3):197-201.

[13]裴迎新,衡正昌,段廣才,等.葉黃素對食管癌細胞凋亡的影響及其作用機制研究[J].中國中藥雜志,2007,32(4):332-334.

[14]Emma A,María M,Inmaculada A,et al.Lutein prevents cataract de?velopment and progression in diabetic rats[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2009,247(1):115-120.