黃芪糖蛋白抑制小鼠EAE的作用研究

章培軍，郭敏芳，張麗紅，楊德兵，孟 健，李加善，馬存根，2＊

（1.山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；2.山西中醫學院，山西 太原 030024）

多發性硬化(multiple sclerosis,MS)是發生在中樞神經系統(CNS)的炎性脫髓鞘疾病,由自身免疫功能異常引起,目前尚無有效藥物根治。實驗性自身免疫性腦脊髓炎 (experim enta l auto immune encephalomyelitis,EAE)是目前研究MS的理想模型。黃芪具有補氣升陽,益氣扶正,益衛固表等功效,研究表明黃芪可作用于多種免疫活性細胞,促進細胞因子分泌,促進體內抗體形成,通過提高機體免疫功能治療免疫系統疾病[1-2]。黃芪在多發性硬化的臨床治療中已廣泛應用,但其具體的作用機制尚不明確。HQGP是山西中醫學院從傳統中藥膜莢黃芪(A straga lusm embranaceus)中通過浸提法分離到的一種天然植物糖蛋白,體外實驗表明其具有一定的免疫抑制作用[3-4]。本研究應用HQGP治療小鼠EAE模型,通過觀察EAE小鼠的臨床癥狀,檢測HQGP對EAE小鼠脾臟淋巴細胞的增殖以及分泌細胞因子的影響,探討HQGP對EAE小鼠的治療作用及其機理。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性C57BL/6小鼠60只,體質量 18～23 g,北京維通利華公司提供;MOG35-55,西安聯美生物科技有限公司產品;結核分歧桿菌(TB)購自BD公司;完全弗氏佐劑 (CFA)購自Sigma公司;百日咳毒素(PTX)購自北京畢特博生物技術有限公司;黃氏糖蛋白由山西中醫學院實驗中心提供。

1.2 EAE動物模型制備

小鼠按平均體質量隨機分為3組,即EAE組、佐劑組和HQGP組 (治療組),每組20只。在EAE組和治療組鼠脊柱兩側分3～4點皮下注射MOG35-55(每只0.1 mL),佐劑組以等量生理鹽水代替[5]。各組小鼠于免疫后當日(第0 d)和第2 d分別給予腹腔注射百日咳毒素 (PTX)700 ng增強免疫。治療組在免疫后第6 d按30 mg/(kg·d)腹腔注射HQGP。

1.3 臨床癥狀評價

小鼠免疫后,隔日稱量體質量,并觀察臨床癥狀,均采用盲法進行。用國際通用評分法進行臨床評分。

1.4 脾細胞的分離和制備

免疫后20 d,每組取8只小鼠,水合氯醛腹腔麻醉,75%酒精消毒,無菌取脾,注射器研磨、過400目篩,加入預冷的PBS中,1200 r/min離心5 min。棄上清,PBS洗3次,按2 mL/管加預冷雙蒸水,30～45 s后按1 mL/管加入預冷的0.027 mg/mL NaCl裂解紅細胞,加PBS至15 mL。1200 r/min離心5 min,棄上清,用含10%胎牛血清的DMEM重懸,計數細胞,最后將各管細胞密度調整至1×109/L,按200 μL/孔 細胞懸液接種于96孔板中,于37℃5%CO2培養箱中培養48 h。

1.5 測定脾臟淋巴細胞增殖(MTT法)

培養48 h后,收集脾淋巴細胞上清液,凍存于-20℃,待測。各組設8個復孔,每孔加5 g/L MTT 35 μL。5%CO2培養箱中培養 4 h,吸干液體后每孔再加入150 μL的二甲基亞砜 (DMSO),震蕩使充分溶解,用酶標儀測定A490值。

1.6 脾淋巴細胞因子檢測

用ELISA法檢測脾淋巴細胞上清液中INF-γ,IL-1β,IL-10和IL-14的含量,測定A450值。

1.7 數據處理

2 結果

2.1 各組小鼠發病及臨床癥狀評分比較

EAE組小鼠自免疫后第9 d開始相繼發病,癥狀有飲食、活動量減少,反應遲鈍,體質量顯著下降等。免疫后第17 d左右達高峰,發病率達85%。與EAE組相比,治療組小鼠癥狀減輕,緩解迅速,病程縮短,行為學評分明顯改善。見表1。

2.2 各組脾臟淋巴細胞增殖比較

與佐劑組比較,EAE組小鼠脾臟淋巴細胞增殖明顯 (P＜0.01),而HQGP治療對淋巴細胞的增殖有明顯抑制作用(P＜0.01),見表 2。

表2 MTT法檢測脾淋巴細胞增殖結果

2.3 細胞因子的檢測結果

ELISA檢測結果顯示 EAE組 INF-γ,IL-1β,IL-103種細胞因子的分泌均增加,但IL-4的分泌沒有明顯變化,HQGP明顯抑制INF-γ、IL-1β的分泌,并且促進IL-10的分泌,而對IL-4的分泌則沒有影響。見圖1。

圖1 各組脾淋巴細胞上清液中INF-γ，IL-17，IL-10和IL-4水平

3 討論

EAE發病的主要機制是CD4+T細胞激活并進入中樞神經系統,產生多種細胞因子而發揮效應,其發生發展過程中有Th2向Th1細胞轉化的趨勢。Th1/Th2細胞分泌的復雜細胞因子網絡在效應T細胞的增殖分化過程中起著重要的作用[5]。INF-γ、TNF-α、IL-1β等主要由Th1細胞分泌,可通過促進淋巴毒素或腫瘤壞死因子等介質的釋放,引起脫髓鞘,使EAE加重;IL-10和IL-4等細胞因子主要由Th2細胞分泌,具有拮抗Th1細胞的作用,從而抑制EAE的發展[6]。IL-10是一種負性免疫調節因子,是由Th2及調節性T細胞分泌產生,能通過降低單核細胞抗原提呈能力而直接抑制抗原特異性T細胞,減少炎癥細胞浸潤,抑制炎癥反應,從而保護機體免受自身免疫反應的攻擊,達到抑制EAE的作用[7-8]。IL-4雖然在EAE發展過程中起抑制作用,但IL-4基因敲除鼠與對照組相比發病率和死亡率相似[9]。

我們利用MOG多肽作為免疫原誘導EAE模型,發現在EAE發病高峰期,脾淋巴細胞的增殖指數比佐劑組明顯增高,淋巴細胞上清液中INF-γ和IL-1β顯著上升。HQGP治療組的臨床評分則明顯降低,癥狀迅速緩解,病程縮短,并且顯著抑制了外周脾淋巴細胞增殖以及INF-γ和IL-1β,而提高IL-10的分泌,但對于IL-4的分泌沒有顯著性影響。推測HQGP可能通過抑制Th1細胞分泌相關細胞因子,促進Th2細胞釋放相關細胞因子,誘導Th1/Th2向Th2細胞方向轉化而發揮作用。因此推測HQGP治療EAE的可能機制是抑制了炎癥反應,從而達到了神經保護作用,為其臨床治療MS提供 了理論依據。

[1]劉莎,符州.黃芪的免疫調節作用及臨床應用[J].國際中醫中藥雜志,2006,28(4):203.

[2]馬晶晶,李明,朱蕓.黃芪的免疫調節作用及在系統性紅斑狼瘡治療中的應用[J].中醫臨床研究,2011,3(19):118-119.

[3]Feng Q J,Xue H Q,Yang X Z,et al.A HuangQi glycoprotein and its preparation and uses:China,200910089580.5[P].2011-02-02.

[4]楊向竹,薛慧清,馮前進,等.黃芪糖蛋白對T淋巴細胞增殖活性的影響[J].上海中醫藥大學學報,2009,23(5):66-68.

[5]段惠潔,郭敏芳,尉杰忠,等.鹽酸法舒地爾抑制小鼠EAE作用及機制研究[J].山西大同大學學報：自然科學版，2010,26(4):53-57.

[6]McGeachy M J,Anderton S M.Cytokines in the induction and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Cy tokines,2005,32(2):81-84.

[7]Xystrakis E,Boswell S E,Hawrylowicz C M.T regulatory cells and the control of allergic disease[J].Expert Opin Biol Ther,2006,6(2):121-133.

[8]Beebe A M,Cua D J,Malefyt R.The role of interleukin-10 in autoimmune disease systemic lupus erythematosus(SLE)and multi ple sclerosis(MS)[J].Cytokine Growth Factor Rev,2002,13(4-5):403-412.

[9]Bettelli E,Das M P,Howard E D,et al.IL-10 is critical in the regulation of autoimmune encephalomyelitisas demonstrated by studies of IL-10 and IL-4-deficient and transgenic mice[J].J Immunol,1998,161(7):3299-3306.