HSP70、突變型P53在復發性、耐藥性卵巢癌中的表達及臨床意義

李雅靜，石 紅

(1.山西省人民醫院，山西 太原 030012;2.大連醫科大學附屬第一醫院，遼寧大連 116011)

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，目前多采取腫瘤細胞減滅術輔以鉑類為基礎化療的綜合治療，但大多數患者會復發或產生耐藥，化療是卵巢癌治療中不可缺少的重要輔助手段。研究表明，HSP70、mtP53可阻止多種化療藥物或放療引起的腫瘤細胞凋亡，抑制化療藥物在腫瘤細胞中的核苷酸改變，導致腫瘤細胞耐藥［1，2］。而E1B缺陷型腺病毒能在P53基因突變腫瘤細胞中有效地復制、溶瘤，同時它還可以顯著增強化療藥物的抗瘤作用，化療藥物及腺病毒溶瘤作用產生的多種腫瘤特異性抗原降解成多肽，可與HSP70結合，形成熱休克蛋白抗原肽復合體(HSP-antigen complex，HAC)，共同表達于細胞表面，可激活機體免疫效應，達到協同抗癌的作用［3，4］。本文采用免疫組化法檢測卵巢癌組織中HSP70和mtP53表達率，同時用Western blot法測定卵巢癌患者血清中HSP70在手術前后、化療前后表達水平，旨在探討E1B缺陷型腺病毒聯合化療在卵巢癌中應用的可行性及應用時機，為解決復發、耐藥性卵巢癌的治療探索一種新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2000年1月至2004年12月山西省人民醫院收治卵巢上皮性癌59例，其初治癌36例，復發癌23例，平均發病年齡為53歲(32～69歲)。根據1985年FIGO分期，Ⅰ期4例，Ⅱ期9例，Ⅲ期40例，Ⅵ期6例。免疫組化法檢測mtP53、HSP70陽性率。對其中31例卵巢癌患者(初治癌29例，復發癌2例)，同時測定手術前后、化療前后末梢血中的HSP70水平。所選患者均為首次治療，術后采用以鉑類藥物為主的聯合化療6～8個療程。應用鉑類藥物化療后、復發時間大于6個月的卵巢癌患者，為對鉑類藥物敏感型卵巢癌;用鉑類藥物化療后、復發時間小于6個月的卵巢癌患者，為對鉑類藥物耐藥型卵巢癌。

1.2 免疫組化染色

采用 EliVisionTM Plus法。步驟如下:a)常規10%甲醛溶液固定組織標本，石蠟包埋，切片厚度4 μm，每個標本均制備蘇木精曙紅(HE)染色對照片。b)石蠟切片脫蠟和水化;高壓鍋抗原修復1.5 min;內源性過氧化物酶阻斷10 min;滴加鼠抗人mtP53單克隆抗體、鼠抗人HSP70抗體(一抗)60 min;加聚合物增強劑(試劑A)20 min;加酶標抗鼠聚合物(試劑B)30 min;加DAB顯色，沖洗、復染、封片。每次染色均用已知陽性的乳腺癌切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。結果判定HSP70陽性為胞漿、胞核著色，mtP53陽性為細胞核著色。陽性標準參考Bosari［5］的方法并略作修改，mtP53:核陽性細胞＜10%為陰性(－);10%≤核陽性細胞＜30%為低度陽性(+);30%≤核陽性細胞＜60%為中度陽性(++);核陽性細胞≥60%為強陽性(+++)。HSP70:(－)為胞漿著色淺棕色，核陽性細胞＜10%;(+)為胞漿著色淺棕色，10%≤核陽性細胞＜50%;(++)為胞漿著色淺棕色，核陽性細胞≥50%或為胞漿著色深棕色，10%≤核陽性細胞＜50%;(+++)為胞漿著色深棕色，核陽性細胞≥50%。

1.3 Western blot法檢測血漿中HSP70水平

步驟如下:a)樣品的收集與處理:抽取患者清晨空腹靜脈血3 mL，加肝素抗凝，離心后分離血漿，低溫－80℃保存，待用。b)考馬斯亮蘭標準曲線法作蛋白濃度測定;各標本每泳道取約20 μg蛋白，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白;將蛋白電轉移至硝酸纖維薄膜(NC膜);5%脫脂奶粉封閉NC膜過夜;與HSP70單抗(1∶200稀釋)37℃3 h;加生物素標記的馬抗小鼠IgG(1∶300稀釋)37℃1 h;加堿磷酶標記的鏈酶親合素(1∶400稀釋)37℃40 min;加 NCIP/NBT顯色，適時終止;結果掃描保存，并用Syngene全自動凝膠成像分析系統分析HSP70的水平(單位:積分光密度)。

1.4 統計學方法

SPSS12.0統計軟件進行數據分析，采用χ2檢驗，t檢驗處理數據，P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 HSP70和mtP53在卵巢上皮腫瘤中的表達

HSP70陽性為胞漿、胞核著色。卵巢癌組織中HSP70總陽性率為67.80%。與復發性卵巢癌組織HSP70總陽性率為78.26%比較，無統計學意義(P＞0.05)。且初治卵巢癌組織陽性率與復發卵巢癌組織中的比較，有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

mtP53定位于細胞核。卵巢癌組織中mtP53陽性率62.71%，其中復發卵巢癌組織中的陽性率為78.26%，強陽性率為43.48%，而初治卵巢癌組織中陽性率為52.78%，強陽性率為22.22%，兩者相比較具有統計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表1 卵巢上皮腫瘤中HSP70表達的陽性率Table 1 Positive Rate of HSP70 Expression in Epithelial Ovarian Tumor

表2 卵巢上皮腫瘤中mtP53表達的陽性率Table 2 Postive Rate of mtP53 Expression in Epithelial Ovarian Tumor

2.2 HSP70、mtP53與卵巢癌進展期及腫瘤分化程度的關系

HSP70、mtP53在進展期卵巢癌中的陽性率均明顯高于早期卵巢癌(P＜0.05);在低分化卵巢癌組織中的陽性率均明顯高于高分化和中分化卵巢癌(P＜0.05)。見表3，表4。

表3 不同進展期HSP70、mtP53陽性率比較 %Table 3 Comparison of HSP70 and mtP53 Positive Rate in Different Progressive Stages %

表4 HSP70、mtP53陽性表達與腫瘤病理分級 %Table 4 HSP70 and mtP53 Postive Expression and Pathologic Grading of Cancer %

2.3 卵巢癌中HSP70表達與mtP53高表達的相關性

卵巢癌中HSP70和mtP53共同陽性率為55.9%(33/59)。37例P53陽性卵巢癌組織中，HSP70陽性33例，陰性4例;而22例mtP53陰性卵巢癌組織中，HSP70陽性7例，陰性15例。兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。其中復發癌中HSP70和mtP53共同陽性率為69.57%(16/23)，初治癌中為47.22%(17/36)，前者明顯高于后者(P ＜0.05)。見表5。

表5 mtP53和HSP70陽性表達在卵巢癌中的關系 例Table 5 Relationship between mtP53 and HSP70 Positive Expression in Epithelial Ovarian Caner case

2.4 復發卵巢癌HSP70、mtP53陽性表達與鉑類耐藥的關系

HSP70、mtP53在鉑類耐藥型卵巢癌中的陽性率(14/16，14/16)均明顯高于非耐藥型卵巢癌(4/7，3/7)(P ＜0.05)。見表6。

表6 HSP70、mtP53在鉑類耐藥型卵巢癌陽性率的比較 %Table 6 HSP70 and mtP53 Positive Rate in Two Recurrent Epithelial Ovarian Cancers %

2.5 血漿中HSP70表達水平在手術前后及化療前后的變化

SDS-PAGE和Western blot檢測結果見表7，圖1，圖2。結果顯示，HSP70在術后2 d、4 d的表達水平較術前明顯升高(P＜0.05)，術后2 d與4 d比較差異無統計學意義(P＞0.05)，術后2 d、4 d明顯高于術后6 d(P ＜0.05)，術后6 d(化療前)與化療后2 d比較，后者表達水平略高于前者，但差異無統計學意義(P＞0.05)，化療后2 d明顯高于化療后4 d、6 d(P ＜0.05)。

表7 手術前后及化療前后血漿HSP70表達水平的比較Table 7 Comparison of HSP70 Expression in Plasma before and after Surgery and Chemotherapy

圖1 SDS-PAGE圖譜顯示血漿HSP70分離情況Fig 1 Separation Condition of Plasma HSP70 in SDS-PAGE Atlas

圖2 血漿HSP70 Western blot顯色情況Fig 2 Coloration Condition of Plasma HSP70 Western Blot

3 討論

3.1 HSP70、P53在卵巢癌中表達的意義

野生型P53(wild type P53，wtP53)為腫瘤抑制基因，被稱為是“基因衛士”，具有穩定細胞基因組的功能。當wtP53基因發生突變時會促進細胞的增殖和轉化，從而失去抑癌作用引起腫瘤的發生。到目前為止，P53基因突變是腫瘤中最為常見的遺傳變異。HSPs是一組廣泛存在于原核、真核生物的高度保守的應激蛋白，參與蛋白折疊、轉運、機體免疫、細胞凋亡等多種生物功能。HSP70是HSP家族中最豐富和最重要的一種。研究表明，HSP70可能在與P53相關的腫瘤發生中扮演重要的角色，它可能通過與mtP53基因及其蛋白產物的相互作用在腫瘤的發生、發展中起作用［6，7］。本研究發現，mtP53和 HSP70在卵巢癌中高表達，其表達與卵巢癌的進展期及細胞分化程度相關，晚期和低分化的卵巢癌中mtP53、HSP70陽性率明顯高于早期和高分化型，提示兩者可作為推測卵巢癌預后的指標。

一方面HSP70、mtP53可能參與腫瘤的發生、發展，另一方面研究發現，許多腫瘤中，P53突變往往引起腫瘤對放化療的不敏感，而且HSP70也通過參與腫瘤細胞周期調控和表型改變，阻止細胞終末分化后凋亡，保護腫瘤細胞免受抗癌藥物、射線照射等因素誘發的凋亡，研究表明mtP53、HSP70可能參與了腫瘤細胞耐藥機制［2，8～10］。本研究發現，復發卵巢癌中鉑類耐藥型卵巢癌mtP53、HSP70表達率明顯高于非耐藥型卵巢癌，且復發性卵巢癌mtP53、HSP70共同陽性率明顯高于初治卵巢癌，表明mtP53、HSP70的相互作用可能在復發性卵巢癌發展中起作用。

3.2 E1B-55KD缺陷型腺病毒聯合化療治療在卵巢癌中應用的可行性及應用時機

治療后容易復發是卵巢癌一大特點，化療耐藥是卵巢癌治療上急需攻克的難題。本實驗數據表明，卵巢癌中mtP53高表達與惡性程度有關，且其高表達還可能直接或間接參與了卵巢癌的耐藥、復發，導致卵巢癌預后不良。研究發現，E1B-55KD缺陷型腺病毒可以選擇性地在P53缺陷型腫瘤細胞或P53正常功能受到抑制的P53野生型腫瘤細胞中復制并裂解殺傷細胞，同時釋放大量子代病毒再感染其他細胞，從而發揮連鎖殺傷的抗腫瘤作用［3，4］。同時它還可以顯著增強化療、放療的抗瘤作用。因此E1B-55KD缺陷型腺病毒聯合化療為治療mtP53高表達的耐藥性、持續性、難治性卵巢癌提供了有效的新的治療手段。目前，用于復發頭頸腫瘤的臨床試驗已經初步顯示了一定的療效和安全性。

另有研究表明，化療殺傷及腺病毒的溶瘤作用在引起腫瘤細胞裂解的同時，產生多種腫瘤特異性抗原(如P53突變癌蛋白和病毒相關抗原)，這些抗原性蛋白降解成多肽后，可以與HSP70結合，形成熱休克蛋白多肽復合物(heat shock protein 70 peptide-complexes，HSP-PC70)具有很強的免疫原性，表達于細胞表面，可激活多個腫瘤特異性細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)克隆，產生抗腫瘤免疫效應［4］。可見E1B-55KD缺陷型腺病毒聯合化療可以同時誘發機體強大的抗腫瘤免疫，兩者結合，協同抗瘤，療效更好。本研究也顯示，HSP70在卵巢癌中高表達，特別是在進展期、低分化、復發耐藥型卵巢癌中表達更強;且其表達與mtP53高表達密切相關，即兩者共同陽性率達69.57%，使溶瘤性腺病毒的應用成為可能。表明在難治性卵巢癌中應用E1B-55KD缺陷型腺病毒聯合化療法，療效可能會更好。那么如何將腺病毒聯合化療法和機體的抗腫瘤免疫效應更加有效地結合起來，應用時機將是治療的關鍵。研究表明，HSP70在細胞核中合成，主要儲存在胞漿中，與血漿中水平相關;且只有在腫瘤細胞中，HSp70才表達于質膜［11］。因此，本研究檢測了31例卵巢癌患者血漿HSP70表達水平，觀察其在手術前后、化療前后的變化，發現術后2～4 d及化療后2 d內HSP70表達量明顯增高。提示，E1B-55KD缺陷型腺病毒聯合化療可以在卵巢癌尤其是復發、耐藥性卵巢癌的治療方面發揮作用。目前關于腹腔注射腺病毒治療鉑類耐藥型卵巢癌患者的Ⅰ期臨床研究正在進行。本研究提示腺病毒應用時機選擇在手術或化療后2 d之內可能效果更佳，為臨床應用E1B-55KD缺陷型腺病毒聯合化療治療難治性卵巢癌的用藥時機提供了理論依據。

［1］Hollstein M，Sidransky D，Vigedstein B，et al.P53 Mutants in Human Cancers［J］.Science，1991，253(5015):49-53.

［2］Kwak HJ，Jun CD，Pae HO，et al.The Role of Inducible 70-KD Heat Shock Protein in Cell Cycle Control，Differentiation ，and Apoptotic Cell Death of the Human Myeloid Leukemic HL-60 cells［J］.Cell Immunol，1998，187(1):1-12

［3］Heise C，Sampson-Johannes A，Williams A ，et al.ONYX-015，an E1B Gene-attenuated Adenovirus，Causes Tumor-specific Cytolysis and Antitumoral Efficacy that can be Augmented by Standard Chemothera Peutic Agents［J］.Nat Med，1997，3(6):639-645

［4］Issii T，Udono H，Yamano T，et al.Isolation of MHC ClassⅠ-Restricted Tumor Antigen Peptide and its Precursors Associated with Heat Shock Protein Hsp70 ，Hsp90，and gp96［J］.J Immunol，1999，162(3):1303-1309.

［5］Bosari S，Viale G，Radaelli U，et al.P53 Accumulation in Ovarian Carcinomas and its Prognostic Implication［J］.Hum Pathol，1993，24:1175.

［6］Agoff SN，Hou J，Linzer DIH，Wu B:Regulation of the Human HSP70 Promoter by p53［J］.1993，259:84-86.

［7］Chang-Soo Park，M.D.，In-Sook Joo，M.D.et al.An Immunohistochemical Analysis of Heat Shock Protein 70，p53，and Estrogen Receptor Status in Carcinoma of the Uterine Cevix［J］.Gynecologic Oncology，1999，74(1):53-60

［8］Witkin SS.Heat Shock Protein Expression and Immunity:Relevance to Gynecologic Oncology［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2001，22(4):249-56.

［9］Liu FF，Miller N，Levin W，et al.The Potential Role of HSP70 as an Indicator of Response to Radiation and Hyperthermia Treatments for Recurrent Breast Cancer［J］.Int J Hyperthermia.1996，12(2):197-210.

［10］何驍生，潘秋萍，鄔堂春，等.Western斑點印跡法檢測主要熱應激蛋白［J］.中國勞動衛生職業病雜志，1996，4(2):376-377.

［11］Vasey PA，Shulman LN，Campos S，et al.Phase I Trial of Intrapefitoneal Injection of the E1B-55-kd·gene-deleted Adenovirus ONYX-015(dll520)Given Oil Days 1 through 5 every 3 Weeks in Patients with Recurrent/Refractory Epithelial Ovarian Cancer［J］.J Clin Onc01.2002，20(6):1562-1569.