胃癌組織中微血管密度與HO-1的表達及其臨床意義*

劉 艷 ，金延安 ，劉俐敏

(1.湖北科技學院臨床醫學院，湖北 咸寧 437100;2.武漢科技大學病理學教研室)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在癌癥病死率中排列第二位［1］，而血管生成在腫瘤細胞的生長及擴散中起核心作用，是胃癌的主要轉移途徑。血紅素氧合酶(heine oxygenase，HO)-1 是一種可誘導型酶蛋白，是機體最重要的內源性防御體系之一，目前研究發現在人體多種腫瘤組織中均可檢測到HO-1 高表達［2］，但其與血管重構及臨床病理關系鮮見報道。本實驗研究胃癌組織中MVD 和HO-1 的表達與血管生成及侵襲轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 標本及來源

選擇2000～2005年咸寧市中心醫院病理科胃癌活檢和手術切除標本61例，其中男36例，女25例，年齡32～76歲，平均(58.3±6.7)歲。根據2002年國際抗癌聯盟(UICC)胃癌TNM分期法，本組病例Ⅰ期9例，Ⅱ期11例，Ⅲ期14例，Ⅳ期27例。取距離癌組織＞5cm 的正常組織28例作為正常對照組。所有患者術前均未進行放化療。標本均經10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋。

1.2 組織芯片制作

選擇所需病例存檔蠟塊，由病理學專家根據蘇木素-伊紅染色法(HE)切片進行形態學觀察，確定具有代表性的病變部位并標記，用組織芯片制作儀在受體蠟塊上打孔(直徑1.5 mm)，然后在供體蠟塊上打孔采集組織芯(直徑1.5 mm)，推入空白陣列模塊中。如此反復將所有組織芯整齊有序地安插在空白蠟塊中，制成組織芯片蠟塊。將制成的組織芯片蠟塊置于模具中，60℃烤箱放置1 h，使蠟塊重新融為一體。將組織芯片蠟塊靜置自然冷卻。將制好的組織芯片蠟塊在輪轉式切片機上做4μm 連續切片，敷貼于1%多聚賴氨酸處理的載玻片上。

1.3 免疫組化

采用UltraSensitive SP 二步免疫組織化學法檢測。UltraSensitive SP 免疫組織化學試劑盒、CD34 鼠抗人單克隆抗體(1∶100 稀釋)和HO-1 即用型鼠抗人單克隆抗體(1∶100 稀釋)均為福州邁新公司產品。按試劑盒說明書方法操作。

1.4 結果判定

①HO-1 染色判斷標準［2］:HO-1 陽性染色顆粒主要位于細胞漿內，其陽性表達的細胞呈棕褐色。低倍鏡下隨機選取10個視野，每個視野計數100個細胞，取其平均值，結果以陽性細胞所占百分比表示。用醫學病理圖像分析系統對圖象進行采集和分析，灰度值數值越小，表明陽性表達越多;②腫瘤組織微血管密度(MVD)計數方法:用CD34 單克隆抗體進行免疫組化染色，標記腫瘤微血管，采用Weidner 法［3］進行計數，先用低倍鏡掃視整個切片，尋找MVD 密度最高的區域，然后在高倍視野下分別計數腫物中心及腫物邊緣的微血管數，共計數5個視野，取平均值來作為該例的MVD。

1.5 統計方法

應用SPSS 11.0 軟件，依據資料類型的不同分別采用χ2檢驗、成組設計的t 檢驗;相關性采用等級相關分析;P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MVD、HO-1 在胃癌組織和正常胃組織中的表達

HO-1 陽性染色顆粒主要位于細胞漿內，癌細胞中呈強陽性表達，表達率為71.4%，在正常胃組織僅有個別細胞呈陽性染色，表達率為11.0%，兩者比較有統計學意義;MVD 在正常胃組織中表達平均值為(43.6±11.2)個/視野，胃癌組織中表達平均值為(62.1±13.1)個/視野，兩者比較也有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

圖1 HO-1 基因免疫組化SP×400

圖2 CD34 免疫組化SP×400

表1 HO-1、MLD 在胃癌及正常胃組織中的表達

表2 MLD 和HO-1 表達與胃癌臨床病理因素之間的關系

2.2 MVD、HO-1 的表達與臨床病理關系

胃癌組織中HO-1 陽性表達與患者性別、年齡的相關性無統計學意義(P＞0.05);而與TNM分期、分化程度、腫瘤浸潤深度的相關性均有統計學意義(P＜0.05)，MVD 值在Ⅲ～Ⅳ期胃癌組顯著高于Ⅰ～Ⅱ期胃癌組(P＜0.01)，在侵及肌層組中的MLD 顯著高于侵及黏膜層組(P＜0.01):與患者性別、年齡的相關性無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.3 MVD、HO-1 表達的相關分析

經Spearman 相關分析，25例HO-1 高表達者MVD 平均值為(62.1±13.1)個/視野，36例HO-1高表達者MVD 平均值為(43.6±11.2)個/視野，兩者在胃癌中表達呈顯著正相關(r=0.4022，P＜0.05)。

3 討論

腫瘤轉移是一個高度復雜及多步驟的過程，是患者死亡的主要原因，而血管生成在腫瘤細胞的生長及擴散中起核心作用。血管重構是血管對各種刺激的復雜動態反應過程，涉及刺激信號的感受、傳導以及細胞因子的合成、釋放等諸多環節。HO-1 通過影響各種信號轉導通路、抗氧化應激、抗凋亡、減輕炎性反應、抑制炎性因子的表達等多種細胞分子機制發揮抗血管重構作用［4］。本研究中發現HO-1 癌細胞中呈強陽性表達，表達率為71.4%，在正常胃組織僅有個別細胞呈陽性染色，與Sasaki T［5］報道一致。有報道在肝癌旁組織也可檢測到HO-1 高表達，人胰腺癌周圍炎性細胞也呈陽性表達［6］，這些現象提示HO-1 表達可能與癌組織周圍炎性反應有關，是因為癌旁組織產生的炎性細胞因子，以及腫瘤病灶周圍積聚的游離鐵離子等刺激HO-1 表達，HO-1 在新生血管生成中起刺激作用，說明HO-1 與腫瘤血管生成密切相關，可能利于胃癌浸潤。因此探討HO-1 在胃癌組織中的表達水平與臨床病理特征的相互關系對研究腫瘤生物學行為極具價值。

HO-1 對血管發生的作用最先是在人神經膠質瘤、人黑素瘤中通過腫瘤巨噬細胞浸潤伴MVD增加這一現象而被認識的［6］，因此MVD 亦能反映HO-1 在血管發生中的作用。目前研究發現HO-1對腫瘤新生血管的影響與巨噬細胞在腫瘤中滲透及血管密度增加有顯著關系［7］，HO-1 通過提高大鼠腫瘤新生血管的生長加速了癌的生長，HO-1抑制劑削弱了裸鼠胃癌的致癌活性［8］。本研究中發現胃癌組織中MVD 、HO-1 陽性表達與患者性別、年齡的相關性無統計學意義(P＞0.05);而與TNM分期、分化程度、腫瘤浸潤深度的相關性均有統計學意義(P＜0.05)。通過以上研究說明HO-1 在新生血管生成中起刺激作用，它對腫瘤組織有保護作用，也可能利于胃癌浸潤轉移，如果抑制HO-1 活性，可能對腫瘤的治療有利。

［1］陸再英，鐘南山.內科學［M］.第7版，北京:人民出版社出版，2008，4(52):396

［2］田飛，張黎，郭瓊行，等.血紅素加氧酶-1 及Toll 樣受體2/4 在直腸癌組織中的表達及意義［J］.中國現代普通外科進展，2008，11(3):248

［3］Weidner N，Spmple JP，Welch WR，et al.Tumor angiogenesis and metastasis.correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl J Med，1991，324(1):1

［4］李琳，趙運梅，沈耀兵，等.血紅素氧合酶-1 與血管重構［J］.中國醫師進修雜志，2009，32(7):70

［5］Sasaki T，Yoshida K，Kondo H，et al.Heme oxygenase-1 accelerate protumoral effects ofnitric oxide in cancer cells［J］.Virchows Arch，2005，446(5):525

［6］惠亮亮，白飛虎，楊力，等.血紅素加氧酶-1 對腫瘤生物學行為的影響研究進展［J］.第四軍醫大學學報，2009，30(20):2245

［7］Hellmuth M，Wetzler C，Nold M，et al.Expression of interleukin-8，heme oxygenase-1 and vascular endotheli algrowth factor in DLD-1 colon carcinoma cells exposed to pyrrolidine dithiocarbamate［J］.Canci nogenesis，2002，23(8):1273

［8］惠亮亮，白飛虎，楊 力，等.血紅素氧合酶-1 抑制劑鋅原卟啉對裸鼠胃癌腹膜轉移的抑制作用［J］.胃腸病學，2008，13(12):723