天麻成分抗花生四烯酸誘導的家兔體外血小板聚集活性研究*

郭營營，林 青，李秀芳

(云南中醫學院，云南昆明 650500)

現代藥理學研究表明天麻、天麻成分及其制劑有擴血管，降低血粘度及抑制血小板聚集等作用［1］。課題組前期研究表明天麻提取物G2(乙酸乙酯部位)具有顯著的抗血小板聚集作用［2］，但其活性成分尚不清楚。在后續的研究中，課題組從天麻提取物G2部分分離純化得到一組脂溶性酚性成分，經初步活性篩選，結果顯示B、C、D成分具有一定的抗AA誘導的家兔體外血小板聚集作用，本實驗在前期研究基礎上，對天麻B、C、D成分及天麻素的抗AA誘導的家兔體外血小板聚集作用進行了考察。

1 材料

1.1 受試藥物

天麻 B、C、D成分由課題組提取分離，經HPLC測定純度均在95%以上;天麻素購自上海百靈威科技有限公司，批號:LotL6B0KO1，純度98%.

1.2 試劑及儀器

枸櫞酸鈉 (批號:A20120416);花生四烯酸(Arachidonic Acid，AA)購自日本 TCI(批號:A0781);Na2CO3(批號:A20120313);吐溫 (批號:090711);氯化鈉注射液 (批號:A11011505);LBY－NJ2四通道血小板聚集儀 (北京普利生科貿集團);臺式低速離心機 (上海電機廠)。

1.3 實驗動物

日本大耳白兔，體重2.0～2.5kg，雌雄兼用，由四川省醫學科學院實驗動物研究所提供，動物合格證號:SCXK(川)2008－24。

2 天麻B、C、D成分提取分離

2.1 天麻提取物G2部位的制備

天麻生藥粗粉 (2kg)，用95%的乙醇浸泡6h，連續回流提取3次，回流提取時間為每次3h。獲得總提取物G1后，減壓濃縮得到深褐色糖漿狀醇提物，取G1用蒸餾水溶解，加入石油醚反復萃取至石油醚層無色，合并幾次萃取的石油醚層，回收石油醚，得到天麻提取物石油醚部分;剩余水層加入乙酸乙酯反復萃取至乙酸乙酯層無色，合并幾次萃取的乙酸乙酯層，回收乙酸乙酯，得到天麻提取物G2部位。

2.2 G2硅膠柱色譜分離

取2.1制得的G2部分以硅膠柱色譜分離，用環己烷—乙酸乙酯溶劑系統梯度洗脫 (100∶1～10∶1)，經反復硅膠柱層析結合薄層層析，分離得到化合物B、C、D。

3 Bron法［3］測定血小板聚集功能

用10%的水合氯醛3mL/kg的劑量腹腔注射麻醉家兔，自頸總動脈取血，收集于一次性塑料試管中，采用3.2%枸櫞酸鈉抗凝，取血時試管內枸櫞酸鈉與取血量的比例為1∶9，取后立即顛倒混勻。血液于室溫以1000r/min離心10min得到上層液即富血小板血漿 (platelet rich plasma，PRP)，取上清液后余下以3000r/min離心10min得貧血小板血漿 (platelet poor plasma，PPP)［4］，用比濁法進行血小板聚集性測定，記錄血小板聚集率，并以公式［(對照管聚集率－樣品管聚集率)/對照管聚集率×100%］計算藥物對血小板聚集的抑制率。實驗結果數據以“均數±標準差”表示，組間比較用q檢驗，Logit法計算IC50。

4 結果

4.1 天麻B成分對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響

結果顯示，天麻B成分 (0.4，0.2，0.1mg·mL－1)對AA的家兔體外血小板均有抑制作用，IC50為 0.104mg·mL－1，95% 的 置 信 區 間 為(0.07，0.41)。與空白對照組比較差異有統計學意義 (P＜0.01)，詳見表1:

表1 天麻B成分對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響 (n=6)

4.2 天麻C成分對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響

結果顯示:天麻C成分 (0.4，0.2mg·mL－1)對AA誘導的家兔體外血小板聚集均有抑制作用，IC50為 0.163mg·mL－1，95% 的 置 信 區 間 為(0.09，0.39)。與空白對照組比較差異有統計學意義 (分別有P＜0.01，P＜0.05)，詳見表2:

表2 天麻C成分對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響 (n=6)

4.3 天麻D成分對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響

結果顯示:天麻 D成分 (0.4，0.2mg·mL－1)對AA誘導的家兔體外血小板聚集均有抑制作用，IC50為0.263mg·mL－1，95%的置信區間為 (0.18，0.55)。與空白對照組比較時差異有顯著的統計學意義 (P＜0.01)，詳見表3:

表3 天麻D成分對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響 (n=6)

4.4 天麻素對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響

結果顯示:天麻素5個濃度組對AA誘導的家兔體外血小板聚集率與對照組相比差異無顯著性意義，表明天麻素對AA誘導的家兔體外血小板聚集無明顯影響。詳見表4:

表4 天麻素對AA誘導的家兔體外血小板聚集的影響 (n=6)

5 討論

血栓形成是血液在流動狀態中由于血小板活化和凝血因子被激活而發生的異常凝固。血小板活化是動脈粥樣硬化、心肌梗死、中風等多種心腦血管疾病的重要發病機制之一，采用抗血小板藥物治療上述疾病呈現明顯的改善作用，因此，研究藥物抗血小板活化聚集的作用，對于防治相關疾病以及開發新藥至關重要［5］。花生四烯酸 (AA)是血栓烷A2(TXA2)生物合成的前體，其生理活性是誘導血小板聚集和降低血小板cAMP水平，它是誘發血栓形成、腦缺血、休克等疾病的一種強效血小板聚集促進劑和血管收縮劑［6］。抑制AA代謝的藥物能對其代謝生成TXA2的中間環節發生阻斷作用，從而減少TXA2的生成及其對血管內皮細胞的損傷。課題組前期的研究提示，天麻提取物G2(乙酸乙酯部位)具有一定的抗AA誘導的家兔體外血小板聚集作用，然而尚未見關于其活性成分的報道。本研究結果發現，天麻B、C、D成分對AA誘導的家兔血小板聚集均有一定的抑制作用，IC50分別為0.104，0.163，0.263mg·mL－1，以B成分作用較強。天麻素是天麻的主要成分，藥典中天麻的含量測定也以天麻素作為標準［7］，然而本實驗中，在同等濃度下，天麻素對AA誘導的家兔體外血小板聚集作用不明顯，與課題前期研究結論相符［8］。

［1］Shang W F.Research progress on the effect of Gastrodia［J］.Biochemical Pharmacology，2000，23(1):32 －34.

［2］林青，李秀芳，李文軍，等.天麻提取物對血小板聚集的影響 ［J］.中國微循環，2006，10(1):33.

［3］Born GVR.Aggregation of blood platelets by diphosphate and its reversal［J］.Nature，1962，194;297.

［4］Xu S Y，Bian R L，Chen X.Methodology Pharmacological Experiment(藥理實驗方法學) ［M］.Beijing:People's Medical Publishing House，2002.

［5］De Meyer SF，Deckmyn H，Vanhoorelbeke K.von Willebrand factor to the rescue ［J］.Blood Reviews，2009，113:5049－5057.

［6］Tazawa R，Green ED，Ohashi K，et al.Characterization of the complete genomic structure of human thromboxane syntheses gene and functional analysis of its promoter ［J］.Arch Biochemist Biophys，1996，334(2):349 －356.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:54－55.

［8］孟保華，李文軍，淤澤溥，等.天麻素對家兔體外血小板聚集的影響 ［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(3，4):46－47.