GC/MS法和 UPLC/Q-TOF-MS法研究丹香冠心注射液中的有效成分

王少敏， 胡 青， 季 申

(上海市食品藥品檢驗所，上海201203)

丹香冠心注射液是一種常用的中藥注射液，具有活血化瘀，理氣開竅的功能，臨床用于冠心病、心絞痛、心肌梗死屬瘀血閉阻證等。其不良反應主要為過敏反應，如靜滴時引起頭痛、藥疹、藥物熱、皮膚瘙癢等，少量嚴重不良反應為靜脈炎和過敏性休克、呼吸困難、喉水腫。為明確丹香冠心注射液的組成成分以進一步控制質量安全，對其進行物質基礎研究成為必要。

中藥注射液是一個復雜系統，物質成分眾多，類別多樣，性質差異大，大量成分含量低。傳統的物質基礎研究方式多采用色譜吸附分離技術得到純度高的單體化合物后，再獲取光譜和質譜數據，進行結構鑒定。該方法需要大量的人力物力，耗時長，分離鑒定含量低的成分難度大。近年來，色質聯用技術發展迅速，如氣相色譜/質譜聯用技術(GC－MS)可用于實現揮發油成分快速分離定性，而液相色譜/質譜聯用技術則是研究中藥中非揮發性成分的重要手段，其中超高效液相-四級桿/飛行時間串聯質譜(UPLC-Q/TOF-MS)技術具備分析速度快、高靈敏度、準確質量和全譜記錄等特點，可以提供準確的質量數、碎片信息和可能結構，對于未知化合物的鑒定是強有力的工具［1］。

丹香冠心注射液處方由丹參、降香兩味藥組成，主要工藝為丹參水提醇沉酸堿除雜，降香水蒸氣蒸餾揮發油，二者合并。根據工藝推測，最終產品中應含有丹參水溶性成分和降香的揮發性成分。本實驗分別采用GC/MS和UPLC-Q/TOF-MS技術，對其物質基礎進行了研究。

1 儀器與試藥

美國安捷倫公司Agilent 6890N GC/5973N MSD氣相質譜聯用色譜儀;MSD Chemistation D 03.00.611數據處理系統;美國Waters Acquity@ 超高效液相譜儀色譜儀;美國 Micromass Synapt Q-TOF-MS(四級桿－飛行時間質譜儀);Epppendorf 5810R臺式離心機。甲醇、乙腈為色譜純，由Fluca公司提供，石油醚、乙酸乙酯為農殘級純，由Merck公司提供，

標準物質:反式 －苦橙油醇對照品(批號:0001421969，Sigma公司);降香揮發油對照品(批號:111579-200201);丹參素鈉(批號:110855-200203);原兒茶醛(批號:110810-200205);丹酚酸 B(批號:111562-200302);原兒茶酸(批號:809-200102)均購自中國藥品生物制品檢定所。

丹香冠心注射液:批號:0909025、091003、0911083、0912048、0912065、1001036、1002019、1002060、1003035、1003054(生產企業 A:上海中西制藥有限公司);批號:090508、090510、090720、090812、090917、091101、091107、091222、100304、100306(生產企業B:上海新亞藥業高郵有限公司)。

2 溶液的制備

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 GC－MS對照品溶液 取降香揮發油和反式－苦橙油醇對照品適量，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。

2.1.2 UPLC-Q/TOF-MS對照品溶液的制備 取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、原兒茶酸等對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 GC－MS供試品溶液 取丹香冠心注射液10 mL，置具塞試管加入2 mL石油醚，渦旋2 min，靜置，待分層后，取上清液，備用，下層溶液中加入2 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，靜置，待分層后，取上清液，石油醚液與乙酸乙酯溶液作為不同極性部位供試品溶液進行分析。同時不取樣品溶液，按上述方法，制備相應隨行空白溶液。

2.2.2 UPLC-Q/TOF-MS供試品溶液 取丹香冠心注射液，過0.22 μm的濾膜，取續濾液，即得。

3 色質聯用條件

3.1 GC-MS條件 色譜柱:Agilent Innowax毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序:初始溫度100℃，以2℃/min的速率升溫至200℃并保持5 min，載氣:氦氣，體積流量1.2 mL/min;分流比1∶1;進樣體積1 μL;進樣口溫度:280℃;氣質接口溫度:250℃;電離方式:電子轟擊(E I);電離能量:70 eV;掃描質量范圍:30～600 AMU;掃描間隔:0.5 s。

3.2 UPLC-Q/TOF-MS 條件 UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm ×50 mm);流動相 A 為乙腈，B為0.01%甲酸溶液，體積流量0.3 mL/min;柱溫25℃;進樣量10 μL。采用以下兩種梯度洗脫程序分別對應Q/TOF-MS的正、負離子檢測模式:①0～30 min，5%→30%A;30 ～60 min，30%→50%A，60 ～90 min，50%→70%A，90 ～100 min，70%→95%A;100～110 min 5%A;②:0 ～5 min，5%A;5 ～90 min，5%→22%A，90 ～95 min，22%→95%A，95 ～100 min，5%A。

質譜條件:電噴霧離子源(ESI);采用正、負離子兩種模式檢測，毛細管電壓為3200 V，錐孔電壓為35 V，檢測器電壓為2000 V;脫溶劑氣流為600 L/h，脫溶劑氣流為350℃，錐孔氣流量為50 L/h，離子源溫度為120℃，0.2 s采集一次譜圖;質量校正液(Lockspay)為亮氨酸-腦啡肽(leucine－enkephalin，［M+H］+=556.2771，［M － H］－=554.2615)，質量掃描范圍:m/z 50 ～900。

4 結果

4.1 揮發性物質 對2個廠家的20批樣品進行檢測，結果各廠家生產的10批樣品圖譜基本一致，結合所有供試品溶液總離子流圖譜，扣除相應的隨行溶劑空白中的干擾峰，共檢出25個色譜峰，見圖1。對相對質量分數為99%的19個峰進行質譜掃描后得到質譜圖，經與Nist數據庫和對照品匹配，鑒定出反式－苦橙油醇等6個化合物，另13個化合物經推斷均為苦橙油醇系列衍生物，其中12個化合物組成了三組同分異構體。按各色譜峰的質譜裂片圖與文獻核對［2-6］，對基峰、質荷比和相對豐度等方面進行直觀比較，分別對各個色譜峰加以確認，綜合各項分析鑒定，其中第一組同分異構體:峰5，7，11，12，20(保留時間為 32.6 min，33.5 min、41.2 min、41.7 min、46.5 min)的質譜圖與文獻報道的氧化苦橙油醇一致，推斷該5個色譜峰為氧化苦橙油醇5個同分異構體。第二組同分異構體由峰3，4，6，8，14(保留時間分別為 31.9 min、32.3 min、32.8 min、33.6 min、43.2 min)組成，對其質譜裂片信息進行解析，推測其可能結構為氧化苦橙油醇的一個氫原子被羥基取代。第三組同分異構體:峰13和峰15(保留時間分別為42.7 min、44.2 min)的質譜圖中具有與第二組相似的裂片:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 125.1，m/z 195.2，而峰 18(保留時間為 46.0 min)則具有與第三組相似的裂片信息:m/z 55.1，m/z 70.0，m/z 111.1，m/z 125.1，m/z 195.2，說明其均為結構相似的苦橙油醇系列化合物，見表1和圖1～2。

圖1 對照品及丹香冠心注射液樣品GC/MS總離子流圖Fig.1 GC/MS ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

4.2 水溶性成分 同一廠家生產的10批樣品圖譜基本相似，丹香冠心注射液中水溶性成分主要為來自丹參中的酚酸類物質，在負離子模式下容易帶電荷，另外，為保證某些成分在正離子模式下響應較好，質譜上分別對負離子和正離子兩種模式進行采集，獲得的化合物相互進行補充，按3.2項分析條件，繪制UPLC/Q-TOF-MS BP I正、負離子掃描總離子流圖，見圖3。根據部分標準品定位和文獻進行鑒定［7-12］，結果負離子模式中響應峰較多，鑒別出24個化合物，正離子模式中鑒別出6個化合物，其中5個已在負離子質譜圖中發現，故共鑒定了圖譜中的25個主要色譜峰，見圖3和表2。

表1 丹香冠心注射液中揮發性成分Tab.1 The volatile compounds in Danxiang Guanxin Injection

圖2 反式－苦橙油醇對照品及系列衍生物GC/MS質譜裂片圖Fig.2 GC/MS fracture ion chromatograms of reference substances and it’s derivatives

圖3 丹香冠心注射液的UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖(正、負離子模式)Fig.3 UPLC/Q-TOF-MS total ion chromatograms of reference substances and Danxiang Guanxin Injetion

表2 丹香冠心注射液水溶性成分Tab.2 The water-soluble compounds in Danxiang Guanxin Injection

(續表2)

5 討論

5.1 為完全提取不同極性的揮發性成分，采用石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷、正丁醇不同溶劑依次提取丹香冠心注射液樣品，結果表明三氯甲烷、正丁醇部位總離子流圖中基本無色譜峰，說明石油醚和乙酸乙酯已基本將揮發性成分完全提取。

5.2 對非極性和極性兩種氣相色譜柱進行了考察，并配以相適應的升溫程序，① HP-5毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升溫程序為初始80℃，保持10 min，以5℃/min升至280℃;② Agilent Innowax 毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);梯度升溫程序為初始100℃，以2℃/min升至200℃，保持5 min。結果后者對色譜峰分離度更好，選擇柱②進行分析。

5.3 對UPLC色譜條件進行了考察，采用不同填料(C18和T3硅膠)、不同長度(50 mm，100 mm，150 mm)的3根色譜柱進行了試驗，結果以C18填料、柱長50 mm的UPLC色譜柱得到的譜圖中色譜峰多且分離度好。以乙腈-0.01%甲酸溶液為流動相體系，進行梯度洗脫，乙腈由5%變化至95%，結果發現因樣品中水溶性成分主要為酚酸類，極性較強，多出現在5%～40%乙腈比例，故最終確定以較低乙腈比例的流動相體系進行洗脫，使各化合物分離良好。

5.4 對目前國內市場上的丹香冠心注射液進行了收集，發現目前市場上的丹香冠心注射液均由上海中西制藥有限公司和上海新亞藥業高郵有限公司兩家企業生產。另有獲得批準文號的四家生產企業未進行生產。對上述兩個廠家產品各10批樣品進行物質基礎研究發現，同一廠家的10批產品得到的圖譜非常相似;兩個廠家的水溶性部分成分和強度基本相似，而揮發性成分差別較大。上海中西制藥有限公司的丹香冠心注射液總離子流圖中色譜峰個數較多，且峰強度較大，與降香揮發油對照品圖譜相比，多出包括三組同分異構體共十余個峰，但無反式－苦橙油醇的峰。而上海新亞藥業高郵有限公司的丹香冠心注射液總離子流圖中峰個數較少，整體與降香揮發油對照品的圖譜相似，反式－苦橙油醇色譜峰較明顯，見圖1。推測兩家產品的差異可能是由降香原料和生產工藝中參數的不同造成。

5.5 本次物質基礎研究表明，丹香冠心注射液中的揮發性成分主要由苦橙油醇及其衍生物組成，水溶性成分主要由丹參中的酚酸類成分組成，與根據工藝推測的結果一致。

5.6 色質聯用技術具備分析速度快、高靈敏度、準確質量和全譜記錄等特點，可以提供準確的質量數、碎片信息和可能結構，對于未知化合物的鑒定是強有力的工具。本實驗采用兩種色質聯用技術對已有標準品的化合物進行了準確的定性，并通過質譜碎片信息的研究對丹香冠心注射液中同類組分或同系組分進行大概的結構推測，說明是色質聯用技術研究物質基礎的有力工具，也為物質基礎的研究提供了一種思路。

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