根莖類中藥材有機氯及菊酯類農藥多殘留分析

黃曉會， 薛 健， 吳曉波， 佟鶴芳， 薛 雯， 龐作正

(1.中國醫學科學院中國協和醫科大學藥用植物研究所，北京100193;2.寧夏醫科大學研究生學院，寧夏銀川750004)

中藥材作為中國傳統中醫藥學的一部分，在治病救人方面發揮著重要作用，特別是近年來，人們越來越傾向于回歸自然，選擇毒副作用較小的中成藥作為治療各種疾病的首要手段，同時隨著中國醫療水平的提高，人們在醫藥方面的需求不斷增加，中藥材資源供應愈顯不足，所以現在的大部分中藥材都依賴于人工栽培。為了提高產量，防治病蟲害，種植者頻繁的使用各種農藥，由于他們缺乏對農藥本身的性質、農藥對中草藥的作用機制、農藥殘留特性和規律以及農藥對環境的影響等方面的認識，往往造成中草藥中農藥殘留污染。根莖類藥用植物多為多年生草本植物，如丹參、地黃、板藍根、黃芪等藥材，由于生長時間長，更容易使農藥蓄積，致使農藥殘留超標。農藥殘留超標不僅危害到人類的身體健康，還關系到我國名貴藥材的出口創匯。20世紀80年代末云南省出口日本的三七被大量退貨，目前我國在海外市場又日益受韓國高麗參的排擠，中藥材進口國的技術壁壘，限制了我國中藥材出口［1］，這在某種程度上影響了我國這一天然藥物大國的形象。

有機氯及擬除蟲菊酯類農藥均是廣譜殺蟲劑，廣泛用于殺滅農業害蟲，曾是各國殺蟲劑使用最廣泛的農藥。有機氯農藥因其化學性質穩定，脂溶性大，殘留期長，殘留量高，易在脂肪中蓄積，擬除蟲菊酯類使用后的毒副作用越來越明顯，均可造成慢性中毒，嚴重危及人體健康［1］。世界各國已在20世紀70年代末禁止使用，但是目前仍然在土壤［2］，農產品［3］，中藥材［4-5］中檢測出來，而藥材的種植期長，尤其是多年生的根類藥材，易受其農藥的污染［6］。目前中藥中有機氯農藥殘留量的檢測方法已經收入2010年版中國藥典附錄，但僅限于檢測甘草、黃芪等幾種中藥中的六六六四個異構體、滴滴涕四個異構體和五氯硝基苯共9種有機氯農藥［7］，這與我國500種常用藥材的數量相比還有較大距離，也不能滿足國內外對農藥殘留檢測愈加嚴格的要求。因此，針對各種中藥樣品國內應該盡快進行更多種類的有機氯農藥多殘留分析方法學的摸索研究，以盡快建立一套適合于多種類中藥的比較通用的有機氯和菊酯類農藥多殘留分析方法，以提高中草藥在國際市場上的競爭力。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent-7890氣相色譜儀;Agilent電子捕獲檢測器(ECD);Agilent-G4513A自動進樣器;Agilent-DB1701(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)與 Agilent-HP-5(30 m ×0.32 mm ×0.25 μm)毛細管色譜柱;JSP-750A高速萬能粉碎機(浙江省永康市金穗機械制造廠);PL203/01電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);T-150超聲波清洗器(北京天鵬有限公司);LABORATA-4000旋轉蒸發儀(Heidolph);SHB-B型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)等。

1.2 藥品與試劑 甘草、浙貝母、白芨、牛膝、天麻(購于安國藥市)。正己烷(色譜純 Fisher公司)，乙酸乙酯、無水硫酸鈉、正己烷(分析純北京化工廠)，乙腈(分析純，北京化工廠)，Florisil硅土柱(1000 mg/6 mL，美國Agilent公司)，農藥標準品(德國Dr.Ehrenstorfer公司，美國 Chem Service公司，德國Riedel-deHaen公司，美國Accustandard公司，農業部環境保護科研監測所)，純度均在99.0%以上，詳細信息見表1。

表1 農藥標準品信息Tab.1 Standard of pesticides

2 實驗方法

2.1 提取條件的選擇 通過參考相關有機氯和菊酯類農藥殘留測定的方法，農藥殘留常用的提取方式有振蕩法，索氏提取法，微波輔助提取法等［3］。考慮到實驗室可行條件及此方法適合推廣的要求，本實驗采取了有機溶劑超聲，然后過濾的提取方式。

通過對文獻［8-10］的調查及農藥的溶解性等各方面的因素，初步選擇乙腈、正己烷、正己烷-丙酮(4∶1)、正己烷-乙酸乙酯(4∶1)四種溶劑作為本次提取條件選擇的溶劑種類。考慮到提取時間以及提取溶劑量對提取結果的影響，因此對提取溶劑、提取時間、提取溶劑的體積三種因素進行優化選擇。優化實驗方案見表2。

表2 50種農藥多殘留氣相測定提取方法優化實驗方案表Tab.2 Orthogonal program of extraction

精確稱取2.0 g甘草藥材共5份(其中3份平行，同時做空白和基質添加標準工作溶液各1份)，加入500 μL質量濃度為400 μg/L農藥標準品溶液，混勻過夜。按照正交試驗設計冰浴超聲提取后，再按照2.2項確定的凈化條件凈化，按2.3項測定樣品，根據所得峰面積計算各實驗的回收率，比較得出甘草藥材經30 mL乙腈超聲提取25 min后，提取的雜質較少，提取的農藥的平均回收率在85.3%，各農藥的回收率基本都在這一水平左右，除了pp'-DDD為71.5%、氟胺氰菊酯為73.6%以外，其他都在77.8% ～115.3%之間，而其他的提取系統都有較多不符合農殘測定回收率在75%～125%之間的要求。

提取條件:精密稱取2.0 g樣品，置于100 mL錐形瓶中，加入2.0 g無水硫酸鈉混勻加入乙腈溶劑30 mL，混勻。冰浴超聲提取25 min，過濾。剩余的濾渣入濾紙中，用10 mL乙腈分多次沖洗錐形瓶再淋洗濾渣，合并濾液，于40℃水浴下旋轉蒸發至近干，加入1 mL正己烷溶解，

2.2 凈化條件的選擇 分析試樣中農藥品種的不同以及采用不同的檢測器，對凈化的要求也有所不同。當分析有機氯農藥時，通常采用電子捕獲檢測器，由于該檢測器中放射源易受污染，所以對凈化要求嚴格。

根據文獻［11-13］有機氯和菊酯類農藥多殘留測定樣品處理的凈化柱種類一般為Florisil SPE柱、石墨化碳/氨基 SPE柱、C18SPE柱、中草藥專用柱(TPH)。一般選用的正己烷-丙酮(9∶10)、正己烷-乙酸乙酯(95∶5)、正己烷-乙酸乙酯(85∶15)、而對于C18SPE柱對農藥殘留的洗脫一般用乙腈溶劑，石墨化碳/氨基SPE柱選用乙腈-甲苯(3∶1)。優化實驗方案見表3。

表3 50種農藥多殘留氣相測定凈化方法優化實驗方案表Tab.3 Orthogonal program of purification

精確稱量2.0 g甘草藥材共5份(其中3份平行，同時做空白和基質添加標準工作溶液各1份)，加入500 μL質量濃度為400 μg/L農藥標準品溶液，混勻過夜。按照2.1項的提取方法處理后，濃縮樣品加入用洗脫劑預淋洗后的SPE柱上，樣品瓶用洗脫劑少量多次清洗后上柱，接取所有洗脫液后，在40℃下水浴旋轉濃縮至近干，加入1 mL正己烷，按2.3項下的色譜條件測定樣品，根據所得峰面積計算各實驗的回收率，TPH正己烷-丙酮(9∶1)、Carb-NH2乙腈-甲苯(3∶1)、C18乙腈的總體平均回收率在75.4% ～82.4%之間，且各有較多的回收率不符合要求，用Florisil凈化的總體平均回收率在91.7%～97.9%，符合農殘測定的要求。Florisil SPE柱3個淋洗劑的凈化效果基本相似，沒有非常大的區別，相對而言從整個基線，以及5～20 min這一區間，以正己烷-乙酸乙酯(85∶15)＞正己烷-乙酸乙酯(95∶5)＞正己烷-丙酮(9∶1)。因此本實驗采用Florisil SPE柱為凈化柱，正己烷-乙酸乙酯(85∶15)為洗脫劑的凈化系統。

凈化條件:將Florisil柱置于固定架上，加1 cm左右高度的無水硫酸鈉，用10 mL正己烷-乙酸乙酯(85∶15)的淋洗液進行淋洗，在淋洗液近干時快速移入樣品濃縮液，用50 mL的茄型瓶接收淋出液，用2 mL的淋洗液多次充分的洗脫茄型瓶并轉入柱中，收集洗脫液20 mL，于40℃水浴旋轉濃縮至近干。加入1 mL正己烷溶解，作為樣品溶液備用。

2.3 色譜條件的選擇 參考國際通用的方法，采用2根不同極性的毛細管柱，如果2根不同極性的毛細管柱上同時可檢測出某種農藥，則可判定該樣品中含有此有機氯農藥，選用屬于低極性的HP-5柱和屬于中等極性的DB1701柱，經進樣口、檢測器、柱箱溫度以及載氣流量等試驗，建立的色譜條件可以使50種有機氯農藥得到較好的分離。圖1為50種有機氯及菊酯類農藥在HP-5柱上的出峰順序，圖2為其在DB1701柱上的出峰順序，可以看出在改變柱子的極性后，農藥的出峰時間和出峰順序也發生改變，這樣通過雙柱比對做到互相補充可以幫助排除可能出現假陽性問題。

圖1 50種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥用HP-5柱的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 50 organchlorine and pyrethroid pesticides by HP-5 capillary column

圖2 50種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥用DB1701柱的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 50 organchlorine and pyrethroid pesticides by DB1701 capillary column

色譜條件:彈性石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)HP-5 與 DB1701 雙柱定性，進樣口溫度250℃，不分流進樣;升溫程序為初始溫度120℃保持1 min，以8℃/min的速度升溫至150℃保持2 min，以4℃/min的速度升溫至270℃保持14 min，再以10℃/min的升溫速度升溫至290℃，保持10 min;檢測器溫度300℃;體積流量1 mL/min;進樣量 1 μL。

3 方法學評價

3.1 標準曲線 用標準貯備液分別配制出10、40、80、200、400 μg/L 的標準溶液，按 2.3 項色譜條件進行GC-ECD測定。以峰面積進行回歸計算，得相應農藥的回歸方程，農藥在10～400 μg/L范圍內呈良好的線性關系，r2均大于0.9910。

3.2 儀器的精密度與靈敏度 取100 μg/kg混合標準品溶液重復進樣6次，測得各農藥的RSD值在0.6% ～4.9%之間，說明儀器精密度良好。根據各農藥的信噪比，計算各農藥的檢出線(LOD)2.51～6.86 μg/L。

3.3 加樣回收率與檢測限 按所確定方法對5種藥材分別做回收率實驗。具體做法:取供試品，粉碎，過藥典2號篩，取約2.0 g，一式9份，分別加入一定量的混合標準品溶液，使已知含有量的樣品中農藥質量濃度增加20，80，160 μg/L，每個質量濃度的樣品3份，按以上優化后的實驗方法處理并測定，計算相應回收率及RSD值。同時以最低質量濃度加樣中噪音的3倍計算每種農藥的檢出限，以10倍噪音計算定量限。50種農藥的回收率分別為69.1% ～ 108.3%(甘草樣品)、65.5% ～ 110.4%(浙貝母樣品)、69.8% ～ 107.9%(白芨樣品)、65.6% ～ 111.3%(牛膝樣品)、63.9% ～ 113.0%(天麻樣品)，相對標準偏差均小于18%，檢測限大多低于10 μg/kg，定量限大多低于 35 μg/kg(以牛膝樣品為例)符合農藥殘留痕量測定要求。

3.4 重復性 精密稱定樣品(防己樣品)9份，按2項優化后的實驗條件制備的樣品并進行測定，計算各農藥的RSD均在2.51% ～8.15%之間，方法的重復性良好。

4 實際的樣品測定

稱取以上5種藥材各6個批次，按照2項制備樣品并進氣相測定，外標法定量，1號甘草檢出六氯苯 0.002 μg/g，西瑪津 0.012 μg/g，氯硝銨 0.002 μg/g;2號甘草檢出四氯硝基苯0.078 μg/g，六氯苯0.012 μg/g，溴氰菊酯 0.034 μg/g;3 號浙貝母檢出六氯苯 0.001 μg/g，五氯硝基苯 0.002 μg/g，pp'-DDE 0.005 μg/g;4 號浙貝母六氯苯 0.002 μg/g，五氯硝基苯 0.011 μg/g;6號浙貝母檢出 β-BHC 0.011 μg/g，六氯苯 0.015 μg/g;1 號白芨檢出 δ-BHC 0.002 μg/g;4 號牛膝檢出四氯硝基苯 0.046 μg/g;3號天麻檢出西瑪津0.002 μg/g和5號天麻檢出西瑪津 0.01 μg/g，β-BHC 0.011 μg/g。

5 討論

本實驗所建立的農藥檢測方法是根據中藥本身的特點建立起來的一套系統的針對不同類中藥材的有害殘留物檢測方法，在應用中，各級監測機構可以根據需要選擇使用，能夠滿足科學研究、監管監測、外貿出口檢測等多種需求。多種有害殘留物限量標準的制定也將有利于提高我國中藥行業整體的監管水平，提高我國中藥產品的質量，解決一直沒有標準和方法的尷尬狀況，有力應對國際貿易中對我國中藥產品設置的“綠色壁壘”。

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