金蓮花中葒草苷對人食管癌EC-109腫瘤細胞生長及凋亡的影響

朱登祥， 安 芳， 王書華

(河北北方學院藥學系，河北張家口075000)

金蓮花是毛茛科植物金蓮花Trollius chinensis Bunge的干燥花及花蕾，廣泛分布于西南、西北、華北、東北地區。《本草綱目拾遺》謂其“味苦，性寒，無毒”，可“治口瘡、喉腫、浮熱牙宣、耳疼、目痛”，并具“明目、解嵐障”之功效。前期研究發現，金蓮花總黃酮具有抗氧化、抗腫瘤等作用［1-4］。葒草苷在金蓮花總黃酮中較高［5］，屬于黃酮碳苷類化合物，具有抗氧化、對缺血缺氧心肌良好的保護作用［6-7］，與抗腫瘤作用較強的木犀草素［8］具有相似的化學結構。經對國內外文獻檢索尚未見金蓮花中葒草苷抗腫瘤作用的研究報道。本研究在金蓮花總黃酮抗腫瘤研究基礎上，進一步觀察葒草苷對人食管癌EC-109細胞的抗瘤作用，為確立金蓮花黃酮抗腫瘤藥效物質基礎提供實驗依據。為抗腫瘤藥物的研制與開發提供新的動力。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 EC-109細胞 (購自北京腫瘤研究所遺傳室);細胞培養基RPMI 1640(美國Gibico公司);胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司);CCK-8試劑盒 (上海瑪芝佳公司);細胞凋亡Hoechst染色試劑盒 (晶美生物工程有限公司);Annexin V-FITC試劑盒 (碧云天試劑公司);瓊脂糖、100 bp DNA marker(北京六和同公司)。全自動熒光酶標儀 (Spectra Max，美國分子儀器有限公司);凝膠成像系統 (BioSpectrumAC system，美國 UVP公司);流式細胞儀 (FCM，FACS-Aria美國BD公司);ECLIPSE Ti-U熒光倒置顯微鏡 (日本 Nikon公司);3319型 CO2培養箱(美國Forma公司)。

1.2 葒草苷制備及鑒定［9］

1.2.1 葒草苷提取 稱取一定量潔凈、干燥、粉碎的金蓮花，丙酮脫色素，濾渣干燥后，60%乙醇浸泡，回流提取，濾液減壓濃縮、離心，收集上清液，上清液經AB-8大孔吸附樹脂純化，先用4倍體積的蒸餾水洗去雜質，再依次用4倍體積的10%、70%、95%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液。洗脫液經乙酸乙酯萃取，萃取液經濃縮、真空干燥成固體。得葒草苷粗品。

1.2.2 高效液相色譜分離純化葒草苷 ZORBAX SB-C18色譜柱 (21.2 mm×250 mm，7 μm);流動相為1%乙酸-乙腈 (85∶15);柱溫25℃;體積流量20 mL/min;檢測波長340 nm;進樣量6 mL;餾分收集:基于峰，閾值Min為2.2。

將葒草苷粗品用適量流動相溶解 (超聲助溶)，過0.45 μm微孔濾膜后，在制備型高效液相色譜條件下進樣，將收集得到的葒草苷餾分，減壓濃縮，在－50℃下，真空冷凍干燥，即得淡黃色晶體粉末葒草苷。

1.2.3 高效液相色譜檢測葒草苷純度 Hypersil BDS-C18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動相為1%乙酸-乙腈 (85∶15);檢測波長為340 nm。柱溫30℃。體積流量1 mL/min，進樣量20 μL。將制備所得葒草苷純品配成一定濃度的供試品溶液 (3份)，按色譜條件進行測定 (平行進樣5次)。

1.2.4 NMR鑒定葒草苷結構 將制備所得葒草苷經NMR進行結構鑒定，并與標準品進行對照。

1.3 葒草苷對EC-109細胞生長及凋亡的影響

1.3.1 細胞培養與分組 人食管癌EC-109細胞于37℃飽和濕度、5%CO2條件下，采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基進行培養，在對數生長期進行傳代分組實驗。實驗分組，空白對照組、溶劑對照組 (葒草苷難溶于水，選DMSO為助溶劑，DMSO終質量分數為0.2%)、藥物組 (葒草苷終濃度分別為5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μmol/L)、金蓮花總黃酮為陽性對照組 (質量濃度0.793 g/L［3］)。

1.3.2 細胞生長增殖抑制率檢測 采用CCK-8(cell counting kit)法。取對數生長期的EC-109細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，細胞計數，調整細胞密度，取100 μL單細胞懸液加入96孔板，使每孔細胞1×105個。待細胞貼壁后，輕輕吸去上清，按實驗分組加入相應的藥物100 μL，達到終濃度要求。對照組與葒草苷不同濃度組各設5個復孔，加入藥物，培養至24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8液，繼續培養4 h，采用全自動酶聯免疫檢測儀在450 nm波長測定吸光度值，計算藥物對癌細胞的平均抑制率。

1.3.3 Hoechest33258染色觀察EC-109細胞形態EC-109細胞以每孔900 μL(含5×103細胞)接種于24孔培養板。培養6 h，細胞貼壁后加入100 μL不同處理因素，使葒草苷終濃度為5.0，20.0，80.0 μmol/L。空白對照組不含處理因素。培養48 h后Hoechst33258染色，以紫外光340 nm波長激發，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA Ladder 調整細胞密度為1×106/mL接種于20 mL的培養瓶，2.5 mL/瓶，待細胞貼壁后，加入藥物，葒草苷終濃度為5.0，20.0，80.0 μmol/L三組，設空白對照組。培養48 h后，收集細胞，用PBS洗滌3次，最后1次移入1.5 mL EP管中，加裂解液615 μL，70℃水浴振蕩15 min，重復2次，離心取上清液500 μL，加1000 μL的無水乙醇使DNA析出，離心后用20 μL TE緩沖液 (pH7.4)溶解DNA，按照試劑盒的操作步驟進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳前，用RNA酶 (10 g/L)消化30 min，2%瓊脂糖凝膠電泳60 min，采用凝膠成像系統觀察并拍照。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞早期凋亡 實驗分組及藥物作用時間同1.3.4項。收集對照組及不同濃度藥物作用的EC-109細胞，每組細胞計數為1×106個，離心，棄上清，用冷PBS洗滌2次，按照Hoechst染色試劑盒的說明操作，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。

2 結果

2.1 葒草苷純度及結構鑒定 高效液相色譜檢測葒草苷樣品純度為98.8%，RSD為1.1%。HNMR鑒定葒草苷標準品與制備葒草苷樣品活潑氫化學位移值一致。

2.2 葒草苷對EC-109細胞生長增殖的抑制作用不同濃度的葒草苷對EC-109細胞生長增殖抑制率見表1。

表1 葒草苷對EC-109細胞生長增殖抑制作用(±s，n=5)Tab.1 Inhibitory effect of the growth of orientin in EC-109 cell(±s，n=5)

表1 葒草苷對EC-109細胞生長增殖抑制作用(±s，n=5)Tab.1 Inhibitory effect of the growth of orientin in EC-109 cell(±s，n=5)

葒草苷/(mol·L －1)抑制率/%24 h 48 h 72 h 5.0 5.23±0.12 10.82±0.23 18.38±0.1610.0 8.03±0.20 21.06±0.32 36.65±0.5620.0 14.35±0.43 30.02±0.88 48.78±0.5840.0 20.43±0.51 36.90±0.67 51.04±0.6680.0 34.08±1.16 44.60±1.45 58.80±1.110.2%DMSO 0.66±0.23 0.58±0.15 0.49±0.44

實驗數據顯示DMSO對細胞活性及增殖幾乎沒有影響，最大抑制率沒有超過1%，后面實驗不再設試劑對照組。實驗結果表明，同一時相，不同濃度葒草苷對EC-109細胞生長增殖抑制率隨著用藥濃度的增高而增高 (P＜0.05)，不同時相，同一濃度葒草苷對EC-109細胞抑制率隨時間延長而增加，具有顯著性差異 (P＜0.05)。前期研究表明，金蓮花總黃酮，質量濃度0.793 g/L，作用時間24 h時，對EC-109細胞生長增殖抑制率為28.00%［3］。本研究表明，當葒草苷濃度 80.0 μmol/L(=0.0359 g/L)、作用時間24 h時，其對EC-109細胞生長增殖抑制率為34.08%，提示葒草苷可能是金蓮花總黃酮中對EC-109細胞生長增殖抑制作用的藥效物質之一，且抗瘤活性優于金蓮花總黃酮。

2.3 葒草苷對EC-109細胞核熒光形態的影響 空白對照組細胞核大小較均一，呈圓形或橢圓形，染色質分布均勻，在紫外線下呈均一的藍色熒光，可見處于分裂期的細胞。經葒草苷處理的細胞出現典型的凋亡形態學改變，即胞體縮小，核染色質染色明亮，出現核濃縮、分葉、邊集、核染色質碎裂。隨著藥物濃度增大，凋亡細胞數逐漸增多。見圖1。

圖1 葒草苷對EC-109細胞核形態的影響 (×400)Fig.1 Affection of orientin in EC-109 cell nuclear shape

2.4 葒草苷對EC-109細胞DNA的影響 空白對照組沒有出現梯形DNA Ladder(DNA條帶)，而80.0 μmol/L 藥物組，出現明顯 Ladder，20.0 μmol/L、5.0 μmol/L藥物組的條帶較模糊、變暗，但也有較明顯的效果，見圖2。

2.5 葒草苷對EC-109細胞凋亡率的影響 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標法檢測結果顯示，不同濃度葒草苷均可誘導EC-109細胞凋亡，其凋亡率隨濃度的增大而增加，且不同濃度葒草苷之間凋亡率相比較有顯著性差異 (P＜0.05);較對照組細胞凋亡率顯著升高 (P＜0.01)。結果見表2和圖3。

3 討論

圖2 不同濃度葒草苷對EC-109細胞的影響Fig.2 Affection of orientin in EC-109 cell

表2 不同濃度葒草苷對EC-109細胞凋亡的影響 (±s，n=5)Tab.2 Affection of orientin in EC-109 cell apoptosis(±s，n=5)

表2 不同濃度葒草苷對EC-109細胞凋亡的影響 (±s，n=5)Tab.2 Affection of orientin in EC-109 cell apoptosis(±s，n=5)

樣品 濃度/(mol·L－1) 凋亡率/%0.64±0.12葒草苷 5.0 3.36±0.2020.0 7.21±0.34對照組80.0 28.03±0.64

近年來，許多新藥包括紫杉醇、草酸鉑、伊立替康等應用于食管癌的治療。金蓮花黃酮類物質具有抗氧化、抗腫瘤等作用，研究金蓮花黃酮單體葒草苷抗腫瘤作用有無及強弱是進一步探索金蓮花黃酮藥效物質基礎的開始，為抗腫瘤藥物開發和理論研究打下基礎。

圖3 FCM檢測葒草苷對EC-109細胞凋亡的影響Fig.3 Detectiong the apoptosis rate of EC-109 cell by FCM

本研究表明，葒草苷在5.0～80.0 μmol/L濃度下，有明顯抑制食管癌細胞生長增殖的作用，藥物濃度越高、時間越長，抑制率越高。從時間—劑量效應走勢來看，同一時相，高濃度組起初作用明顯，隨濃度增高，抑制率增高，對同一劑量組來說，未呈現劑量-時間對抑制率的線性正比例關系。提示，理想的藥物作用濃度應該在5.0～80.0 μmol/L之間，癌細胞生長增殖被抑制。不同時相，同一濃度葒草苷對EC-109細胞抑制率為均為20 h＜48 h＜72 h，但未呈現正比例關系。48 h與24 h、48 h與72 h比較，抑制率均具有顯著性差異，提示，研究EC-109細胞的早期凋亡，在48 h檢驗效果應較好。所以后面的三個檢驗細胞凋亡的實驗，藥物作用時間定在48 h。在細胞早期凋亡發生時，細胞核內DNA可控制降解，形成不同長度的核酸片段，這和細胞壞死，DNA降解不同，所以DNA Ladder的出現，意味著凋亡的發生。采用瓊脂糖凝膠電泳與Hoechest33258染色細胞形態學相結合的實驗方法，結果顯示葒草苷具有對EC-109細胞生長抑制效應和誘導凋亡效應，且呈濃度依賴性關系。檢測細胞凋亡，FCM是權威的檢測手段，其不僅能夠定量分析，還可以區分統計壞死的細胞。本實驗中，FCM檢測葒草苷具有誘導EC-109細胞凋亡作用，且呈現劑量依賴性，隨藥物濃度的增加凋亡的發生率也隨之增加 (P＜0.05)。值得注意的是，FCM檢測圖顯示，伴隨著凋亡細胞的增多，死亡細胞數目也在同步增加。

綜上分析，葒草苷對EC-109細胞具有抑制細胞生長增殖作用，能夠誘導食管癌EC-109細胞出現早期凋亡。由此可見葒草苷作為一種黃酮碳苷有可能成為一種新型抗食管癌的藥物。

致謝:本實驗葒草苷H-NMR數據在中科院化學所核磁組完成。

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