熊果酸自微乳給藥系統的制備及質量評價

欽富華，林杭娟，高建青

（1.浙江醫藥高等專科學校，浙江 寧波 315100；2.浙江大學藥學院，浙江 杭州 310058）

熊果酸又名烏索酸，是廣泛存在于植物中的五環三萜類化合物。研究表明熊果酸具有抗肝炎、抗菌、抗腫瘤、抗潰瘍、降低血糖等廣泛的生物學效應，且毒性低，不良反應小，具有廣泛的開發前景［1-2］。熊果酸在水中的溶解度極小，溶出速度很慢，生物利用度低。已有文獻報道將熊果酸制成固體分散體、包合物、滴丸及納米粒等［3-6］，以期提高其溶出及口服生物利用度。

自微乳化給藥體系 (self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)是由油相、表面活性劑及助表面活性劑組成的均一、透明的溶液，一旦與水相混合，在環境溫度(通常指體溫37℃)下只需要溫和攪拌就能自發形成透明或者半透明的微乳。微乳可增加藥物的溶解度和吸收面積，處方中含有表面活性劑，可提高藥物的溶出，增加小腸上皮的滲透性，有助于提高藥物的生物利用度［7-8］。自微乳化給藥體系制備簡單，性質穩定，將溶液分裝于軟膠囊中，劑量準確且服用方便，是提高難溶性藥物口服吸收的良好載體。本研究制備了熊果酸自微乳制劑，并對其體外性質進行了考察。

1 材料與儀器

1.1 材料 熊果酸對照品 (上海源葉生物科技有限公司，批號YY20100425)；熊果酸原料藥 (西安飛達生物技術有限公司，純度＞98%)；Labrafil M 1944CS、Labrasol、Transcutol P(法國佳法賽公司)；Cremophor EL(德國巴斯夫公司)；甲醇、乙腈為色譜純，其他藥品、試劑均為國產分析純。

1.2 儀器 Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀 (美國戴安公司)；Nanosize-90粒徑測定儀 (馬爾文儀器有限公司)；TU-1810SPC型紫外分光光度計 (北京普析通用儀器有限公司)；SHA-B型數顯水浴恒溫振蕩器 (上海金鵬分析儀器有限公司)；SB25-120超聲波清洗機 (寧波新芝生物科技股份有限公司)；METTLER TOLEDO電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；高速離心機 (上海安亭科學儀器廠)。

2 方法與結果

2.1 熊果酸HPLC方法的建立［9］色譜條件 Agilent TCC18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相為乙腈-0.3%磷酸 (85∶15)；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為210 nm；柱溫為30℃；進樣量為20 μL。在上述色譜條件下，熊果酸色譜峰理論塔板數大于3000，輔料不干擾熊果酸的測定。熊果酸質量濃度在2.5～120 mg/L的范圍內與峰面積呈良好的線性關系，A=0.0852ρ+0.0033，r=0.9999，高、中、低質量濃度的平均回收率為101.3%、101.7%和101.9%，RSD為0.15%、1.11%和1.59%。日內和日間精密度 (RSD)均小于2.0%，符合含量測定要求。

2.2 熊果酸自微乳的處方篩選

2.2.1 熊果酸在油相、乳化劑和助乳化劑中溶解度考察

本研究選擇了植物油、油酸乙酯等不同的油相，吐溫、Cremophor EL等HLB值較高的乳化劑及乙醇、PEG400等助乳化劑，進行了熊果酸的溶解度考察。各取約2 g的油相、乳化劑及助乳化劑，加入過量的熊果酸，渦旋分散均勻，25℃水浴平衡48 h，10000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾，續濾液用甲醇稀釋適宜倍數后用HPLC測定。平衡溶解度結果顯示熊果酸在油相中溶解不理想，在油酸乙酯和Labrafil M 1944 CS中相對較好，分別為 (1.41±0.07)mg/g和 (2.35±0.26)mg/g；在乳化劑和助乳化劑中，特別是Cremophor EL和Transcutol P中溶解較好，分別為 (10.80±1.58)mg/g和 (10.76±1.21)mg/g。

2.2.2 油和乳化劑的配伍 將油相與乳化劑按2∶3(w/w)的比例在37℃的水浴中振蕩混合后觀察其分散情況，再加入100倍量的蒸餾水，輕微振蕩，觀察其乳化情況。根據文獻將自微乳化情況分為5個級別:(A)溶液呈澄清或微泛藍色；(B)略濁，呈藍白色；(C)呈亮白色不透明液體；(D)色澤暗，呈灰白色，略帶油狀；(E)難乳化，一直有油滴存在。結果見表1。配伍實驗表明以Cremophor EL為乳化劑的乳化效果最為理想，外觀呈現透明帶藍色乳光，因此確定乳化劑為Cremophor EL。以辛癸酸甘油酯、肉豆蔻酸異丙酯和油酸乙酯為油相的效果相差不大，但結合考慮藥物的溶解能力，最終確定油酸乙酯為油相。

表1 不同油相和乳化劑的的配伍情況

2.2.3 助乳化劑的選擇 采用滴定法繪制偽三元相圖，固定油相為油酸乙酯、表面活性劑為Cremophor EL，考察不同助表面活性劑無水乙醇、1，2—丙二醇、PEG400和Transcutol P形成微乳的能力，將表面活性劑和助表面活性劑按質量比 (Km)1∶1混勻，再與油相以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例混勻。37℃水浴磁力攪拌條件下，滴加水相至形成澄清透明溶液，記錄微乳形成時各組分的量，Origin軟件繪制偽三元相圖。以相圖中微乳存在區域的大小來篩選助乳化劑，結果見圖1。從相圖中可知，以PEG400為助乳化劑時所形成的微乳區域最大，但是由于PEG400和Cremophor EL的互不相溶性，自乳化濃縮液不澄明，體系不穩定。以Transcutol P、乙醇和1，2—丙二醇為助乳化劑時效果相似，但Transcutol P略好，同時藥物在Transcutol P中的溶解度較大，故選擇Transcutol P為助乳化劑。

圖1 含不同助乳化劑的相圖

2.2.4 處方優化 對EO/Cremophor EL/Transcutol P進一步進行優化，考察不同Km對自微乳化區域的影響，以粒徑大小和分布情況、體系載藥量大小為評價指標，最終確定體系的組成為油相為油酸乙酯 (15.0%)，表面活性劑為Cremophor EL(40.0%)，助表面活性劑為 Transcutol P(45%)，熊果酸質量分數為10 mg/g。

2.3 微乳形態和粒徑分布 取熊果酸SMEDDS，加蒸餾水稀釋50倍，待自乳化完全后，取適量滴在銅網上，用2%的磷鎢酸 (pH4.47)負染色，晾干后電鏡觀察 (見圖2)，并用粒徑測定儀測定微乳的粒徑和電位 (見圖3)。熊果酸SMEDDS用蒸餾水稀釋50倍后形成的微乳在電鏡下觀察，乳滴呈圓球形，形態良好。粒徑分析儀測定微乳的平均粒徑為23.18 nm，多分散指數PDI為0.146，粒徑分布集中。微乳的zeta電位為－5.35 mv。

圖2 熊果酸微乳透射電鏡照片 (×29000)

圖3 熊果酸微乳粒徑分布圖

2.4 體外溶出 取自制熊果酸自微乳膠囊 (含熊果酸5 mg)和熊果酸膠囊 (含熊果酸10 mg)，按照《中國藥典》2010年版附錄溶出度測定法 (轉籃法)測定，以0.5%十二烷基硫酸鈉水溶液500 mL為溶出介質，轉速100 r/min，溫度37℃。依法操作，分別于5、10、20、30、45、60 min取樣5 mL，立即補充5 mL介質。樣品經0.45 μm濾膜濾過后，取續濾液，加甲醇稀釋后HPLC法測定，外標法計算溶出介質中熊果酸含有量，計算累積溶出百分數，結果見圖4。體外溶出結果表明，熊果酸SMEDDS在10 min內溶出達80%以上，而膠囊60 min溶出僅20%左右。SMEDDS可大大提高熊果酸的體外溶出。

圖4 熊果酸SMEDDS與熊果酸膠囊的體外溶出比較

3 討論

3.1 溶解度測定的過程中，表面活性劑、助表面活性劑和多數油相均能溶于甲醇，但是植物油、色拉油、橄欖油等不能完全溶于甲醇，故本實驗采用了甲醇提取的方法，將少量植物油與甲醇渦旋混合、離心取上清液后測定。

3.2 根據Pouton［10］提出的脂質制劑的分類方法，可以將自微乳化制劑歸納為兩類，一類是油相比例較高且不含助乳化劑，一類是油相比例較低并含有助乳化劑。由于熊果酸在油相中的溶解度不是很理想，而在助乳化劑中溶解度較好，因此本研究選擇含助乳化劑的體系。助乳化劑的作用一方面協助降低油水界面張力促使微乳易于形成；另一方面也是很重要的助溶劑，能提高微乳的載藥量。

3.3 在處方優化的過程中，本研究考察了Km對微乳區域形成的影響，Km增加，微乳形成的區域變大，但是相應的體系的黏度也增大，自微乳化的時間延長。Km值減小，乳滴的粒徑變大，且會出現藥物析出的現象，可能是助乳化劑中藥物被大量稀釋后出現“擱淺”現象。

3.4 中藥中提取得到的大多數活性成分水溶性均較差，其體外溶出和口服生物利用度較低。自微乳制劑能明顯地提高藥物的溶出并增加吸收，是難溶性中藥的有效載體。自微乳制劑已被證明能增加熊果酸的體內吸收。歐曉霞等［11］以油酸為油相、吐溫20和乳化劑OP為乳化劑、異丙醇為助乳化劑制備了熊果酸的自微乳制劑，并以緩釋片和混懸液為對照，進行了大鼠體內生物利用度的研究，結果表明自微乳制劑的相對生物利用度為326.5%。本制劑的體內吸收情況有待于研究。

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