定心藤總黃酮的提取及抗氧化活性的研究

黃 瓊，田玉紅，蒲 香

（廣西工學院生物與化學工程系，廣西 柳州 545006）

定心藤Mappianthus iodoies為茶茱萸科定心藤屬Mappianthus植物，木質藤本，核果橢圓形，果肉薄而甜，為廣西瑤醫常用藥材“十八鉆”之一［1］，其根或老藤有祛風活絡，除濕消腫和消炎的功效，臨床可用于毒蛇咬傷及黃疸的治療［2］，定心藤中主要含有黃酮，有機酸，生物堿，萜類，甾醇，鞣質等多種化學成分，黃酮類物質具有抗腫瘤、護肝、抗炎、抗病毒、調解內分泌系統等功效［3］。有關植物定心藤的研究已有文獻報道［1-2，4-5］，但利用微波輔助提取定心藤中的黃酮及其抗氧化活性的研究還未見報道。本研究通過正交實驗考察了微波法從定心藤中提取黃酮類化合物影響的主要因素，研究了提取工藝條件，并通過DPPH·法初步探討了定心藤總黃酮的抗氧化活性，旨在為定心藤進一步研究和資源開發利用提供一定的科學依據。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器 定心藤 (購于廣西柳州藥材市場)，粉碎后過十目篩得定心藤細粉；蘆丁對照品購于上海市友思生物技術公司；1，1-二苯基苦基苯肼 (1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)購于日本東京化成工業株式會社；乙醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；氫氧化鈉；以上化學試劑均為分析純；紫外分光光度計 (UV2000型)，上海分析儀器總廠；微波爐(WG800SL23-K6)，廣東格蘭仕集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 定心藤總黃酮供試液的制備 稱取一定量的定心藤粉末，加入一定量的乙醇溶液微波輔助提取一定時間，得總黃酮提取液，待測。每個實驗在相同條件下提取3個平行樣。

1.2.2 總黃酮測定方法［6］吸取一定量的黃酮提取液于50 mL比色管中，加入1.0 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻、放置6 min后，加入1.0 mL 10%的Al(NO3)3溶液，搖勻、放置6 min后，加入10 mL 10%的NaOH溶液，加蒸餾水定容至25 mL。放置15 min后，以試劑為空白，于510 nm處測定吸光度A值。從工作曲線方程中計算出總黃酮含有量。

1.2.3 標準曲線的制備 按前述方法，測定不同質量濃度的蘆丁溶液的吸光度，得到蘆丁溶液質量濃度 (mg/mL)與吸光度值關系曲線。

1.2.4 定心藤中總黃酮提取的工藝設計 選擇提取時間、含乙醇量、提取溫度、固液比4個因素為考察因素，選用L9(34)正交表對樣品中總黃酮提取工藝進行試驗。

1.2.5 對羥自由基清除率的測定方法［7-9］將最佳工藝條件下提取的定心藤提取液干燥后，以無水乙醇為溶劑，配制成一定濃度的溶液。準確稱量DPPH固體，并將其配制成質量濃度20 mg/mL溶液，避光保存。在10.0 mL的具塞刻度試管中依次加入2 mL DPPH溶液，再加入一定量的不同體積的靈香草提取物溶液，以無水乙醇補加至4.0 mL刻度，充分混合均勻。同時開始計時，在517 nm處測定不同質量濃度的定心藤提取物在各個時間點的吸光度，為能更好的反映變化趨勢，實驗選擇的質量濃度按照雙倍稀釋法來定。

定義定心藤提取物抗氧化劑對DPPH自由基清除率為［9-10］:

式中:Ai=2 mL DPPH溶液+各個質量濃度定心藤提取物的吸光度 (樣品對DPPH·作用后的吸光度數值)；Aj=各個濃度定心藤提取物溶液在體系中未加DPPH溶液時的本底吸光度 (反映樣品自身對吸光度的貢獻)；Ac=2 mL DPPH溶液+2 mL無水乙醇的吸光度 (為DPPH本身在測定波長的吸收)。

2 結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線 由前述方法進行實驗操作，質量濃度C與吸光度A作標準曲線回歸運算，得回歸方程:C=0.0949A+0.001；r=0.9996，線性范圍 8.48～43.2 μg/mL。

2.2 定心藤總黃酮提取的正交試驗設計 結果見表1。

表1 正交試驗設計結果

從表1正交試驗數據及計算結果可知，因素對提取率 影響程度從強到弱依次是:固液比、微波作用功率、微波作用時間、含乙醇量。由K值可以判斷最佳工藝條件為A2B3C2D3，即微波功率處于中高火、含乙醇量65%、微波作用時間2 min、固液比1∶40。

最佳工藝驗證實驗:按最優方案提取定心藤總黃酮，得總黃酮提取率為23.017%，優于正交實驗及單因素中的任何一組實驗，因此可以確認該方案為最優。

2.3 對羥基自由基的清除作用 按照實驗方法，將所得的結果吸光度值進行數據處理，求得清除率后作圖，圖1顯示了定心藤提取物對DPPH清除率與時間、濃度的關系，發現定心藤提取物對DPPH的清除率隨質量濃度的增大而增大，隨時間的增長而增大，50 min后各濃度對其清除率基本穩定不變。

圖1 定心藤總黃酮對DPPH的清除能力

根據圖1顯示結果檢測不同質量濃度定心藤提取物60 min時對DPPH的清除率，將所得的結果吸光度值進行數據處理求得清除率后與質量濃度作圖得圖2。

圖2 定心藤總黃酮不同質量濃度對DPPH清除能力的關系

由圖2可知，定心藤總黃酮對DPPH自由基清除率在60 min時清除率與質量濃度呈對數關系，線性擬合程度良好。

定義IC50為當清除率達到50%時抗氧化劑樣品的濃度，則由擬合對數曲線公式y=9.8845ln(x)+122.33(R=0.9944)，計算得定心藤總黃酮IC50為6.63×10－4mg/mL。對比合成抗氧化劑特丁基對苯二酚 (TBHQ)、丁基羥基茴香醚 (BHA)結果見表2。

表2 定心藤總黃酮與其他合成抗氧化劑比較分析

IC50越小，說明其抗氧化活性越強。由表2可知，抗氧化性能強弱順序如下:

TBHQ＞定心藤總黃酮＞BHA，定心藤總黃酮具有較強的抗氧化性能。

3 結論

近年來，大量的體內和體外研究表明黃酮類化合物具有較強的抗氧化和清除自由基的活性，同時還具有抑菌、抗衰老、抗心肌缺血、降血脂、降血壓等藥理保健功能且毒副作用很小，是一類極具開發前景的天然有機抗氧化劑［11］。

本實驗通過正交試驗確定了微波輔助提取定心藤總黃酮的最佳工藝條件，即微波功率處于中高火、含乙醇量65%、微波作用時間2 min、固液比1:40，在此條件下總黃酮提取率為23.017%，提取率略高于柯永建等［4］用超聲波提取的提取率 (17.7%)，而比曾立等［5］用乙醇回流提取高出許多，且用時短，說明微波輔助提取定心藤總黃酮方便、快捷、提取率高，具有明顯的優勢。

通過考察對DPPH·自由基的清除能力，發現定心藤總黃酮具有較強的抗氧化性能，優于合成抗氧化劑BHA，可為開發一種新型的天然抗氧化劑提供實驗依據，也為定心藤進一步研究和資源開發利用提供一定的科學依據。

［1］曾 立，尹文清，王安偉，等.定心藤中酚性成分的研究［J］.中華中醫藥雜志，2011，35(4):216-218.

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［5］曾 立，尹文清，王安偉，等.正交試驗優選定心藤中總黃酮提取與純化工藝［J］.中國藥房，2008，19(6):418-419

［6］Gao Min，Liu Chun-zhao.Comparison of techniques for the extraction of flavonoids from cultured cells of Saussurea medusa Maxim ［J］. World J MicrobiolBiotechnol， 2005，21:1461-1463.

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